小麥單倍體誘導技術及其應用

董艷輝 ，于宇鳳 ，趙興華 ，王長彪 ，任永康 ，唐朝暉

（1.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031；2.太原市外國語學校，山西太原030027；3.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030032）

單倍體是指具有配子染色體數的個體，利用小麥單倍體誘導技術產生單倍體并加倍獲得全部基因同質的純合二倍體純系，是快速培育小麥新品種和構建特殊遺傳群體的重要途徑[1]。目前，小麥單倍體獲得途徑主要包括花藥培養、花粉（小孢子）培養、異源種屬花粉誘導（染色體消除）以及輻射和化學試劑處理等[2]。其中以小麥花藥培養技術獲得小麥單倍體比較成熟，現已建立了完整的技術體系，選育了諸如京花1號、京花10號、花培3號、花培5號、花培6號、奎花1號、陜農28等一系列優良的小麥品種，其在生產上大面積推廣種植，取得了良好的社會經濟效益[3]。

本文綜述了目前主要的小麥單倍體誘導技術在國內外的最新研究進展及其在應用中存在的問題，旨在為相關專業研究人員提供參考，促進小麥單倍體育種技術的進一步發展和完善。

1 小麥單倍體誘導技術

1.1 花藥培養技術

小麥花藥培養育種是20世紀70年代開始發展起來的一種新型育種方法，以其周期短、性狀選擇準確、創造變異和DH群體快等獨特優勢受到小麥育種者的高度重視，其在理論和應用研究方面都得到了較大的發展，已經形成一個比較完善的育種技術體系。但是該技術還存在基因型依賴、白化苗等問題，限制了小麥花藥培養的綠苗分化率。

小麥花藥培養力高低受自身基因型的顯著影響，不同品種的花藥愈傷組織誘導率差異比較大。韓曉峰等[4]通過對不同親本組合進行研究，結果表明，花藥培養力的遺傳為多基因控制的數量性狀，通過橋梁親本可以改善花藥培養力低但農藝性狀優良的親本，一定程度上降低了基因型依賴性對小麥花藥培養的影響；徐龍珠等[5]通過對同一組合的正交反交研究表明，母本對花培誘導率的影響大于父本，可能存在著細胞質效應；康明輝等[6]通過長期的實踐指出，在選配親本時除了要考慮花培效率高的橋梁親本，還要兼顧中心親本的優良性狀，以提高花藥培養后代優良基因型出現的概率。

大量研究表明，小麥花藥培養中會產生大量的白化苗。花粉白化苗的大量存在成為禾本科植物花藥培養在育種實踐上應用的重要障礙，因此，研究白化苗的成因、尋求控制方法不僅是花藥培養中亟待解決的問題，而且對探討發育遺傳學、高等植物的基因調控等重要理論問題也意義重大。白化苗的產生受基因型、培養基、培養條件等因素的影響，通過改善這些因素可在一定程度上減少白化苗的產生，但還未達到理想的效果。葉興國等[7-8]利用RAPD分析了來自同一基因型的綠苗和白化苗，結果表明，白化苗的發生屬于遺傳原因，是染色體上DNA結構的改變引起控制葉綠素的基因突變，而不同基因型對培養基的化學成分敏感度不同，導致不同基因型白化苗率不同；Torp等[9]應用RFLP技術成功檢測到3個與綠苗再生相關的QTL位點，分別在2AL，2BL，5BL上；海燕等[10]在分化培養基上附加稀土的研究表明，附加1.5 mg/L的稀土能夠顯著提高花粉綠苗分化率，從13.72%提高到27.51%；蔣寧等[11]通過對大量雜交組合花藥培養的誘導培養基中添加植物生長調節劑4PU-30的研究表明，適宜濃度的4PU-30能顯著提高愈傷組織分化綠苗的比例，降低白化苗的比例。因此，隨著研究的不斷深入、材料的不斷積累和培養基的不斷調整，小麥花藥培養技術正向著更能克服各種限制因素的方向發展。

1.2 花粉（小孢子）培養技術

小孢子培養是在花藥培養的基礎上發展起來的一種高效再生技術體系，屬于單細胞培養，與屬于器官培養的花藥培養不同。與花藥培養相比，小孢子培養主要是通過胚胎發生途徑發育成植株，避免了愈傷組織階段，減少因孢子體變異而引起的農藝性狀退化，顯著提高單倍體產生頻率和減少白化苗的產生量[3]。因此，國內外都開展了此項研究，并且在甘藍型油菜、馬鈴薯、大麥、水稻、玉米、小麥、亞麻等糧經作物以及眾多蕓薹屬蔬菜上獲得成功。

小孢子培養技術在麥類作物中的大麥上研究比較深入，但直到1993年Tuvesson等[12]才成功地報道小麥的小孢子培養植株。近年來，國際上有關花粉培養技術的研究進展很大，已成功建立了小麥小孢子的培養體系，同時在克服基因型限制問題上也有了一定的進展。目前，用于小麥小孢子的分離方法共有4種，即振蕩、漂浮、離析和攪拌。Gustafson等[13]通過測定分離后的小孢子活力對4種分離方法進行比較研究認為，振蕩方法是最佳的分離方法，在游離小孢子培養的液體培養基中加入未成熟子房，可以大大改善小孢子的培養反應，提高胚胎的發生頻率。Mejza等[14]研究認為，子房對小孢子起到一種看護作用，小孢子胚胎的形成是子房的生物功能，但具體作用機理還不清楚。Scott等[15]在麥芽糖以及麥芽糖結合不同濃度的葡萄糖、蔗糖和甘露糖的對比試驗中發現，只含有麥芽糖的培養基能有效地誘導小麥小孢子發育成胚胎，而在含有其他種類碳源的培養基上，小孢子開始積累淀粉粒，最終死亡，沒能成功地誘導出胚胎。還有研究表明，低溫處理、饑餓加高溫脅迫處理能夠有效提高小孢子胚胎發生率。但饑餓加高溫脅迫處理是否會對小孢子胚胎自然加倍率產生負面影響還需要進一步研究。

與花藥培養相似，小麥小孢子培養中也存在白化苗和基因型限制問題。小孢子培養的研究表明，再生苗中白化苗的比率存在明顯的基因型依賴性，有的基因型再生苗中70%為綠苗，而有的基因型中只有少數幾株綠苗，這還有待于進一步研究。值得高興的是，小孢子培養中基因型限制問題比花藥培養中表現得要輕。Touraev等[16]通過前期的脅迫處理和小孢子的分離純化，在供試的若干基因型中都以較高頻率得到了胚胎，其中包括在花藥培養中反應極差的基因型。說明小麥單倍體生產中基因型限制問題有望通過小孢子培養得到克服。

1.3 異源種屬花粉誘導（染色體消除）

Wilson[17]首次進行小麥與黑麥屬間雜交，開拓了小麥遠緣雜交育種的新領域。后來，隨著小麥遠緣雜交工作的不斷進展，人們逐漸發現，在小麥與大麥、玉米、高粱、珍珠粟、大芻草的雜交中都能有效地誘導小麥單倍體的產生，但是種間雜交導致體細胞染色體消失的分子基礎尚不清楚。有一種假說認為，存在種間差異的親本著絲粒與紡錘體之間發生互作而導致染色體選擇性消失。

Lein[18]研究發現，小麥與黑麥的可交配性是由Kr1，Kr2這2個顯性基因控制，并推測Kr基因可能控制著普通小麥與其他種屬雜交的親和性。因而，可交配基因Kr的發現為小麥遠緣雜交奠定了理論基礎。宋仁敬[19]成功地用球莖大麥法獲得了小麥單倍體，但是，由于許多小麥品種帶有顯性Kr1和Kr2基因，限制了小麥與四倍體球莖大麥雜交產生單倍體的方法在育種上的應用。

Zenkteler等[20]首次報道了玉米花粉誘導小麥獲得球形胚。現有研究表明，玉米對小麥可交配基因Kr不敏感，單倍體的產生對于小麥基因型沒有嚴格的選擇，開辟了小麥單倍體育種的新途徑。Laurie[21]首次利用小穗培養法獲得小麥與玉米雜交產生的單倍體植株。Niroula等[22]研究了玉米基因型對胚形成和幼苗再生的影響，結果表明，玉米基因型對單倍體胚形成和小穗再生的差異很大。因此，通過選擇和培育更敏感的玉米基因型可以提高單倍體胚誘導。小麥×玉米誘導單倍體誘導技術具有單倍體誘導效率高、不產生白化苗和誘導小麥單倍體遺傳穩定性高等優點，經過近年來迅速發展，該方法已成為目前國內外產生小麥單倍體的重要途徑。

最新研究表明[23-24]，通過對著絲粒特異性組蛋白基因CENH3進行改造得到突變體，然后雜交得到雜合型合子，由于雙方親本的著絲粒互作，使得來自突變體的染色體組在合子的有絲分裂中丟失，經發育得到只含有非突變體親本一套染色體的植株，單倍體誘導率達50%。這一技術已在擬南芥試驗中取得成功，由于CENH3普遍存在于真核生物中，且擬南芥細胞中著絲粒的DNA結構與大部分植物細胞內的著絲粒DNA結構有很大的相似性，因此，相信這一方法也可用于小麥單倍體育種中。

1.4 輻射和化學誘導

利用X，γ，32P，60Co等射線和紫外線照射花粉，然后給去雄的母本授粉，刺激卵細胞分裂并發育成單倍體的胚胎，從而得到母系單倍體植株。這一項技術已經在很多植物中取得成功。

化學藥劑誘導小麥孤雌生殖在育種實踐上有一定的目的性和預見性，操作相對簡便，成本也較低。但存在因誘導效果差而造成優良基因型丟失的缺點。目前，主要誘導藥劑有：DMSO，BA，KT，2，4-D，NAA，GA3，TRTA，DMSO＋對氯苯氧乙酸，DMSO＋KT，DMSO＋GA3，DMSO＋NAA，DMSO＋KT＋鄰氯苯氧乙酸和甲苯胺藍等。

該方法適合小麥花藥培養、花粉（小孢子）培養不易成功的基因型，選擇合適的輻射劑量或藥劑濃度是該方法成功的關鍵，也是本研究的難點。

2 小麥單倍體加倍

小麥單倍體誘導技術已經被廣大小麥育種者廣泛應用，但是單倍體植株的加倍問題依舊是育種者需要進一步探討和解決的問題，目前主要的方法有自然加倍和人工加倍。

花藥、花粉（小孢子）培養得到的單倍體植株都具有自然加倍的現象，但因基因型等的不同自然加倍率也有所不同。花藥培養植株自然加倍率一般在20%～30%之間[25]；小麥的小孢子培養中，有20%～78%的再生綠色植株是加倍的，具體的加倍機理還不清楚。但是通過一些處理方法也能夠提高自然加倍率，比如冷處理、饑餓處理和高溫脅迫等，冷處理能夠提高自然加倍率已經在花藥培養和小孢子培養中得到證實。異源種屬花粉誘導獲得的小麥單倍體染色體自然加倍現象較少，特別是小麥×玉米產生的植株基本上是單倍體。

由于自然加倍率低，且部分單倍體無自然加倍現象，因此，對于小麥單倍體植株加倍，許多小麥育種者進行了多方面的試驗研究，提出過多種加倍方法，其中秋水仙堿法應用比較廣泛。目前，報道較多的是用高濃度的秋水仙堿處理幼苗根部，但是高濃度的秋水仙堿對植株的毒害作用比較大，加倍處理后較難成活，降低了加倍率；同時由于秋水仙堿作用停止后，會產生部分非二倍體植株。有報道用一定濃度的秋水仙堿和DMSO結合處理單倍體植株，加倍效率顯著提高；河南省農業科學院海燕等[25]設計的小麥半浸根染色體加倍技術，加倍后成活株率達98.1%；成活株加倍結實株率穩定在80%，在花藥培養獲得的幼苗中取得了良好的應用效果。

目前，通過秋水仙堿等化學藥品的處理，不需要任何特定的基因型很容易能獲得小麥加倍單倍體，但染色體自然加倍所形成的加倍單倍體和人工加倍獲得的加倍單倍體不同，前者除整雙二倍體外常還有非整倍體，利用這些非整倍體可培育添加系、替換系等，還可用來進行基因定位，在引入外源基因的雜交育種中，這些非整倍體的應用要比整倍體更為廣泛。所以，很多組培工作者仍然采用單倍體植株的自然加倍方法：為了進一步利用自然加倍不成功的單倍體植株，以保住特定情況下的優良材料，研究人員采用單倍體植株幼穗或者葉片進行離體培養，使其再次自然加倍，并且已經取得了成功。

3 展望

從小麥雜交育種到現在可以預見性地通過多種途徑獲得優良小麥材料，這不得不說是小麥單倍體誘導技術的巨大貢獻。目前，其已在小麥基礎研究和育種方面發揮了重要的作用，但是這些技術的應用僅僅局限于在相對較短的時間內得到基因型純合的小麥植株和實現雜種優勢育種方面，有關小麥自然加倍和人工加倍倍性效應表達調控機理以及遺傳行為的研究只是局限在基因組的某個特異位點，還不能極大地滿足小麥育種的需求。可以預見，隨著染色體工程的建立與應用，RNAi等一系列先進技術的涌現，自然加倍與人工加倍植株的加倍機理和遺傳行為進一步明確，將為小麥單倍體育種研究提供更為廣闊的思路與方法。

［1］蘇維，常彩濤.辣椒單倍體培養研究進展 [J].天津農業科學，2010，16（4）：11-14.

［2］Konieczny R.Two pathways of plant regeneration in wheat anther culture[J].Plant Cell Tissue Organ Cult，2003，73：177-187.

［3］馬強，余國東，李伯群，等.小麥單倍體誘導技術研究進展[J].南方農業，2010（11）：72-76.

［4］韓曉峰，陶麗莉，殷桂香，等.基因型和環境條件對小麥花藥培養效果的影響[J].作物學報，2010，36（7）：1209-1215.

［5］徐龍珠，薛建平，石靈.基因型對小麥花藥培養的影響[J].河南師范大學學報，1991（2）：100-104.

［6］康明輝，海燕，黃冰艷，等.從花培品種的選育談小麥花培育種策略[J].麥類作物學報，2009，29（3）：548-551.

［7］葉興國，徐惠君，徐瓊芳，等.小麥花藥培養力的基因型差異和配合力分析[J].中國農業科學，1997，30（6）：49-54.

［8］張艷敏，郭北海，李洪杰，等.小麥花藥培養的基因型差異與雜交組合配制[J].華北農學報，2002，17（2）：16-19.

［9］Torp A M.Chromosomal regions associated with green plant regenration in wheat anther culture[J].Euphytica，2001，119：377-387.

［10］海燕，康明輝，黃冰艷，等.小麥花藥培養高效育種技術體系的構建及其應用[J].中國科技成果，2011（4）：30-32.

［11］蔣寧，章靜娟，沈曉蓉，等.植物生長調節劑4PU-30對小麥花藥培養效果的影響[J].江蘇農業學報，1997，13（3）：149-153.

［12］Turvesson IK D，Ohulnd RCV.Plant regeneration through culture of isolated microsporesof Triticum aestivum L.[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1993，34：163-167．

［13］Gustafson D P，Stephen Baenziger.Isolated wheat microspore culture[J].Plant Cell Tissueand Organ Culture，1995，42：207-213.

［14］Mejza SJ，Morgant V.Plant regeneration from isolated microspores of Triticum aestivum[J].Plant Cell Report，1993，12：149-153.

［15］Scott P，Lyne PL.Theeffect of different carbohydratesourcesupon the initiation of embryogenesis from barley microspores[J].Plant Cell Tissueand Organ Culture，1994，36：129-133.

［16］ Touraev A，Indrianto A.Efficient microspore embryogenesis in wheat induced by starvation at high temperature[J].Sex Plant Reprod，1996，9：209-215.

［17］Wilson A S.Wheat and ryehybrids[M].Edinburgh：Bat Sac Trans，1876：286-288.

［18］ Lein A.Die genetische Grundlage der Kreuzbarkeit zwischen Weizen and Roggen Zeischr Indukt[J].Abstammun and Vererbungsl，1943，81：28-61.

［19］宋仁敬.利用球莖大麥雜交誘導單倍體的研究[J].貴州農業科學，1982（2）：1-7.

［20］Zenkteler M，Nitzsche W.Wide hybridization experimentsin cereals[J].Theor App1 Genet，1984，68：311-315.

［21］ Laurie D A.Wheat maize hybridization[J].Can J Genet Cytol，1986，28：313-316.

［22］ Niroula R K，Thapa D B，Bimb H P，et al.Production of haploid wheat plant fromwheat×maizecross system[J].Himalayan Journal of Sciences，2007，4（6）：65-69.

［23］Ravi M，Chan SW.Haploid plantsproduced by centromere-mediated genomeelimination[J].Nature，2010，4：6-8.

［24］Chan SW.Hromosome engineering:Power tools for plant genetics[J].Trends Biotechnol，2010，28（12）：605-610.

［25］海燕，康明輝，趙永英，等.河南省農科院小麥花藥培養技術及其應用研究概況[J].河南農業科學，2009（9）：31-33.