多重耐藥鮑曼不動桿菌的臨床分布及其外排泵基因型分析

孫靜娜，劉澤世，王國欣，劉青松，張 征

(1河北醫科大學第一醫院，石家莊050031;2容城縣人民醫院)

鮑曼不動桿菌可以在住院患者中發生定植，很容易通過交叉感染在醫院內流行，而且多重耐藥鮑曼不動桿菌日趨增多，尤其在ICU、嚴重燒傷病房的耐藥菌株的出現，給臨床抗感染治療帶來很大困難。主動外排泵系統是多重耐藥鮑曼不動桿菌臨床分離菌株產生多藥耐藥性的主要機制之一［1］，參與了鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物、β-內酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環素的耐藥。本研究對多重耐藥鮑曼不動桿菌在不同臨床科室的分布情況及其外排泵基因型進行了分析。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2012～2013年河北醫科大學第一醫院不同科室送檢的標本(包括痰液、尿液及血液等)中分離出的多重耐藥鮑曼不動桿菌共96株(同一患者多次分離到的同一菌株不重復計數)。取純培養細菌增菌液1 mL與0.5 mL的50%甘油肉湯混勻，-70℃冰箱保存并備用。標準菌株鮑曼不動桿菌(ATCC 19606)購自衛生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器及設備 Maxwell16核酸提取儀為美國Promega公司產品;Mini-4K/6K微型離心機為珠海黑馬醫學儀器有限公司產品;AB 9700PCR擴增儀為美國AB公司產品;DYY-12電泳儀為北京六一儀器廠產品;VilBer LouRMAT凝膠成像系統為法國VILBER LOURMAT公司產品;SIGMA 3-18K臺式冷凍離心機為德國Sigma公司產品。

1.3 試劑 外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM及16SRNA的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。DNA提取試劑盒Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit和 PCR擴增 GoTaq? Green Master Mix、GoTaq? Colorless Master Mix購自美國Promega公司。DNA染色劑Goldview、DNA Ladder Marker購自北京賽百盛公司。瓊脂糖X-gal購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.4 多重耐藥鮑曼不動桿菌在不同臨床科室的分布情況統計 按臨床科室統計96株多重耐藥鮑曼不動桿菌的分布情況。

1.5 多重耐藥鮑曼不動桿菌外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 的檢測 用 PCR 技術檢測。①DNA提取:使用Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit試劑盒，操作見說明書。②adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因 PCR 引物設計:根據GenBank中的各型基因序列并參考文獻［2］自行設計基因引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。adeB:擴增產物長度約541 bp，引物A為5'-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3'(AF370885)，引物B為5'-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3'AF370 885);adeR:擴增產物長度約447 bp，引物A為5'-ACTACGATATTGGCGACATT-3'(AY426969)，引物B為5'-GCGTCAGATTAAGCAAGATT-3'(AY426969);adeS:擴增產物長度約544 bp，引物A為5'-TTGGTTAGCCACTGTTATCT-3'(AY426969)，引物 B為5'-AGTGGACGTTAGGTCAAGTT-3'(AY426969);adeJ:擴增產物長度約453 bp，引物 A為5'-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3'(AY769962)，引物 B為 5'-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3'(AY769962);adeE:擴增產物長度約504 bp，引物A為5'-GAGCTGAGGATTCTCTATGT-3'(DQ223769)，引物B為 5'-AGTGTGCTCACCATATAGTC-3'(DQ223769);adeM:擴增產物長度約303 bp，引物 A為5'-GTAGGTGTAGGCTTATGGA-3'(AY147867);引物 B為5'-GTACCGAAGTGACTGAAAT-3'(AY147867)。③PCR反應體系及條件:PCR反應體系(25 μL)配置:DNA模板4 μL，引物 A 和引物 B 各 1 μL，2 × GoTaq? Green Master Mix 12.5 μL，RNase-free 水 6.5 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min，然后進入循環;94℃變性1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃ 延伸 1 min，共進行30個循環;最后72℃延伸5 min。④PCR反應產物電泳、判定:緩沖液0.5×TBE，電壓100 V，上樣標本量 8 μL，DNA 分子量 Maker(100 bp)8 μL，電泳50 min，置于全自動凝膠圖像成像儀上觀察結果并照相，出現與目的基因片段分子相當的條帶判為陽性。

2 結果

2.1 多重耐藥鮑曼不動桿菌在不同臨床科室的分布 96株多重耐藥鮑曼不動桿菌分布在ICU 52株(54.2%)、呼吸內科 18 株(18.8%)、燒傷科 9 株(9.4%)、腫瘤科6 株(6.2%)、普外科4 株(4.2%)、腎內科 2 株(2.1%)、心內科 2 株(2.1%)、兒科 2 株(2.1%)、精神科1 株(1.0%)，主要分布在 ICU 和呼吸內科。

2.2 多重耐藥鮑曼不動桿菌的外排泵基因型 96株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因者分別有 33、32、33、33、0、33株，陽性檢出率分別為 34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。分布在 ICU 的52株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因者分別有 18、16、18、18、0、18 株，陽性檢出率分別為 34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%;分布在呼吸內科的18株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因者分別有 9、8、8、8、0、8 株，陽性檢出率分別為50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%。

3 討論

由于鮑曼不動桿菌在自然環境和醫院環境中普遍存在，而且具有極強的環境適應能力和快速獲得耐藥性的能力，因而鮑曼不動桿菌是引起院內感染的最為重要的機會致病菌之一［3］。鮑曼不動桿菌通過其酶機制、外排泵等極容易形成耐藥菌株［4］。主動外排泵是由菌體細胞膜表面蛋白組成的，可以將進入細菌體內的抗菌藥物經外排泵排出到細胞外，而外排泵的過度表達引起喹諾酮類、氨基糖苷類、大環內酯類抗菌藥物及氯霉素的敏感性降低［5，6］。臺灣學者 Sun 等［7］研究發現 adeB 的高表達與鮑曼不動桿菌臨床株對替加環素的耐藥性有關。聯合用藥成為治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的新選擇，并防止耐藥菌株的產生和醫院內感染的擴散［8～10］。

本研究結果顯示，96株多重耐藥鮑曼不動桿菌中，分布于 ICU的占54.2%，與李娟等［11］報道來自ICU的鮑曼不動桿菌占66.9%基本一致，表明ICU是多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的高發病區，可能是與ICU患者自身基礎性疾病較重、免疫力低下、大量使用抗菌藥物、大多數患者有機械通氣及介入治療的醫療行為給該菌的感染提供了有利環境及途徑有關［12］。分布于呼吸內科的多重耐藥鮑曼不動桿菌占18.8%，其他的分布在燒傷科、腫瘤科、普外科、兒科、心內科、精神科等多個科室。上述結果表明，在不同的環境中，鮑曼不動桿菌的分布不同，在患者病情嚴重、住院時間長、機體免疫力下降，尤其是長時間機械通氣時，多重耐藥鮑曼不動桿菌的感染逐漸增多。

在本研究中，96株多重耐藥鮑曼不動桿菌外排泵adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 檢出陽性率分別為34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。Marchand等［13］提出，adeR和adeS的出現可能與adeABC的過表達相關，增加了耐藥的概率。Yoon等［14］認為，AdeR是一個典型的調節轉錄因子，AdeS激活細菌組氨酸激酶，二者一起針對外界刺激調節目的基因表達。上述結果表明，外排泵基因的存在是鮑曼不動桿菌出現多重耐藥的重要機制。

分布在ICU的52株多重耐藥鮑曼不動桿菌中adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因檢出陽性率分別為34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%，與總的檢出陽性率基本一致;分布在呼吸內科的18株多重耐藥鮑曼不動桿菌中 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因檢出陽性率分別為50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%，與總的檢出陽性率相比高出11.11%～16.67%。這可能與ICU中的醫護人員對多重耐藥菌感染防治意識較強、工作更加規范有關。

總之，本研究結果表明多重耐藥鮑曼不動桿菌主要分布在 ICU(54.2%)和呼吸內科(18.8%)，其外排泵基因型主要為 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeM，這是鮑曼不動桿菌發生多重耐藥的重要因素。

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