蛋白質翻譯后修飾研究概述

邱望仁 鄒國英 查娟娟 霍立田

(景德鎮陶瓷學院信息工程學院，江西 景德鎮 333403)

0 引言

在整個生物發展過程中，蛋白質翻譯后修飾可以協調并控制絕大多數蛋白的活躍程度，正是因為有蛋白質翻譯后修飾，使得一個基因并非只對應一個蛋白質，從而賦予了人類生命過程更多的復雜性。因此對這一過程的蛋白進行注解變得不容或缺。在基礎醫學和對疾病機理的研究中，熟知人類在各階段的生長發育期及心理、病理發生改變的原因和情況對研究各類基因進行細胞表達所具有特征擁有特別意義。對這一方面的探究或許能發現與存在特殊的心理及病理狀態有聯系的分子，而這些分子為將來構思針對于特定靶分子的藥用蛋白打下了良好根基。因此，了解蛋白翻譯后修飾的原理、種類及作用對防患重大癌癥有特殊功效。

1 常見的翻譯后修飾的類型及生物功能

蛋白質的翻譯后修飾進程具有繁雜性及多樣性，現今在對真核生物的探究中，就發現了20多種不同的修飾范例。在目前的探究發現，比較常用的類別就有甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化、酯基化以及近年發現的泛素化與SUMO化這七種［1］。

1.1 甲基化

甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質或核酸等進行化學修飾形成甲基化產物。甲基化是蛋白質和核酸的一種重要的翻譯修飾，調節基因的表達和關閉，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關，是表觀遺傳學的重要研究內容之一。最常見的甲基化修飾有DNA甲基化和組蛋白甲基化［2］。

1.2 乙酰化

乙酰化其主要講把一種乙酰官能基團添加到另一種有機化合物上，并進行結合的過程。

蛋白質中的賴氨酸乙酰化修飾調控蛋白質的多種性質，包括DNA-蛋白質相互作用、蛋白質穩定性、亞細胞定位、轉錄活性等［3］。除了這些重要的生物學功能以外，賴氨酸乙酰化蛋白質及其調控酶與衰老及幾種重大疾病(如癌癥、心血管疾病、神經變形紊亂等)緊密相關。最近，Kim Orth及其同事在研究耶爾森菌屬的效應因子YopJ(一個細菌毒力因子)時，發現在真核生物中存在著一種重要的翻譯后修飾形式:絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾。絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化和O-糖基化修飾可以導致細胞信號傳導機制的重大改變，Kim Orth及其同事發現在YopJ中，絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾與這些氨基酸的磷酸化修飾相互競爭，從而改變細胞的信號通路機制。

1.3 糖基化

糖基化的過程主要是在糖基轉移酶的幫助下，使低聚糖以糖苷的方式移動到蛋白質分子上，并與蛋白質分子上特定的氨基酸殘基進行共價結合作用而構成糖苷鍵的經過。蛋白質發生糖基化反應，從而有糖蛋白這種物質的產生，此過程一般在內質網上發生，并且糖基化擁有很多功效，主要是對調控蛋白質發生修飾和改善蛋白質的生物作用［4］。

1.4 磷酸化

蛋白質磷酸化指由蛋白質激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸)上的過程，是生物體內一種普通的調節方式，在細胞信號轉導的過程中起重要作用。蛋白質進行磷酸化是所有生物中進行的最廣泛、最獨特，并且亦是最具效率的一類蛋白質翻譯后修飾進程。在生物體中，進行磷脂化修飾的蛋白只有三分之一，別看這個數目小，但其實相對其他修飾而言其修飾是非常龐大的。并且研究發現，有幾百種磷酸激活酶已經被人類基因翻譯及轉錄過［5］。其與多個生理有關，并和疾病的產生過程有一定的聯系，如:神經的活躍、信號的傳導、細胞的生長發育、腫瘤癌的產生及肌肉頻繁萎縮等。

1.5 酯基化

蛋白質酯基化的一般作用過程是利用氧和硫原子使脂鏈連接到蛋白物質上，從而形成脂蛋白的綴合物，在這個進程中常會有蛋白分子內所含的半胱氨酸發生法呢基烷基化，或者棕櫚酰基乙酰化，其作用位點通常是硫鍵。硫和氧原子被修飾的脂鏈能改變所結合蛋白的功能，因為這個蛋白中的生物磷脂膜能與脂鏈相互吸引并溶合，所以此蛋白會被牽制在細胞膜上不能動彈，其功能也就受到限制及改變。

由于具有脂鏈的蛋白能促使其在特定的細胞膜上進行固定，而且能夠調控此蛋白施展其有益及高效的生物作用［6］。最近幾年，有科學家證明，脂蛋白綴合物要想正常發揮其生物功能，必須首先被吸收到細胞膜上才可以，所以蛋白酯基化的作用是不容忽視的。

1.6 泛素化

泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細胞內的蛋白質分類，從中選出靶蛋白分子，并對靶蛋白進行特異性修飾的過程。蛋白質泛素化作用是后翻譯修飾的一種常見形式，該過程能夠調節不同細胞途徑中各式各樣的蛋白質泛素蛋白底物。泛素化在蛋白質的定位、代謝、功能、調節和降解中都起著十分重要的作用。同時，它也參與了細胞周期、增殖、凋亡、分化、轉移、基因表達、轉錄調節、信號傳遞、損傷修復、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調控。泛素化與腫瘤、心血管等疾病的發病密切相關［7］。因此，作為近年來生物化學研究的一個重大成果，它已然成為研究、開發新藥物的新靶點。

1.7 SUMO化

SUMO(small ubiquitin—related modifier)分子結構和SUMO化反應途徑都與泛素相似，都參與蛋白質翻譯后修飾，SUMO化修飾與泛素化修飾二者的功能上完全不同。SUMO化修飾可參與轉錄調節、核轉運、維持基因組完整性與信號轉導等多種細胞內活動，是一種重要的多功能的蛋白質翻譯后修飾方式。和泛素化不同的是SUMO化修飾不會導致蛋白質的降解，但作用于不同底物會產生不一樣的影響，也就是說，SUMO化修飾的后效取決于它作用的底物［8］。但是它們都是一些重要的細胞調節蛋白。SUMO生物功能表現在以下6個方面:(1)蛋白的亞細胞定位;(2)轉錄活性調控;(3)蛋白穩定性調節;(4)細胞周期調控;(5)維持基因組完整性;(6)信號轉導調控。

2 研究方法及關鍵技術

2.1 甲基化研究方法及關鍵技術

2.1.1 甲基化特異性的PCR

其基本原理是把所有的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理，如此做是因為尚未發生甲基化修飾的胞嘧啶都會被作用變為尿嘧啶，但進行甲基化修飾的胞嘧啶則不會發生改變［9］。由上面的原理可知，采用不同種類的引物做PCR，即可檢測出這種微弱的變化，這樣就能確定基因是否存在甲基化。

2.1.2 亞硫酸氫鹽測序法

它是利用重亞硫酸鹽對DNA進行處理，此過程會使沒有進行甲基化的胞嘧啶變為尿嘧啶，但進行甲基化的基團則不會。然后把經作用的物質為基礎，加入甲基化特異性的物質(primerI)或者非甲基化的物質(primerII)，使其進行特異性的擴增［10］。

2.1.3 高分辨率熔解曲線法

在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經PCR擴增后轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發生改變，從而導致熔解溫度的變化。

2.2 乙酰化研究方法及關鍵技術

2.2.1 通過生物質譜鑒定乙酰化修飾位點［11］

質譜技術通過檢測到的肽段的質量與預測的肽段的質量進行對比，如果二者質量相差42amu，則認為在氨基酸殘基或在蛋白質末端發生乙酰化修飾。通過從鑒定到的肽段的N末端或C末端逐個分析得到的b離子或y離子，就可以確定發生乙酰化修飾的氨基酸位點。

2.2.2 基于特異性識別乙酰化賴氨酸殘基的乙酰化抗體

對于賴氨酸的乙酰化修飾，Kim及其同事用免疫親和純化技術富集賴氨酸乙酰化修飾的肽段，在Hela細胞的細胞質、細胞核和線粒體中發現了195種賴氨酸乙酰化修飾蛋白。但是，賴氨酸乙酰化抗體只能特異性識別賴氨酸殘基發生修飾的蛋白質或肽段，不能檢測到絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾。用特異性識別絲氨酸或蘇氨酸乙酰化修飾的抗體將大大有利于絲氨酸和蘇氨酸乙酰化修飾的蛋白質組學分析。

2.2.3 以標記底物為基礎的方法

Yu及其同事在酶GNAT的作用下，用氯代乙酰化CoA與其作用底物L12反應，導致氯代乙酰化L12的生成。然后將氯代乙酰化L12與熒光素His18俘獲的肽段一起孵育，經過氯消除后，純化后的標記的底物通過熒光自顯影便可看到。

德育教育與知識教學是相輔相成的。學生只學到知識而沒有基本品德的建立，那么我們培養的僅僅是“書呆子”。學生學習成績不好，但是有良好的思想品德，我相信這樣的學生也是會得到社會的認可的。因此，德育教育比知識教育更為重要，有良好的思想品德作基礎，我們的基礎教學可以更高效地開展。在實際工作中，有效開展德育工作可以從以下幾點入手。

2.3 糖基化的研究方法及關鍵技術

2.3.1 放射性標記法

其過程分為以下幾步進行:首先，是對所需的糖進行特殊標記;其次，把處理好的糖加入培育好的細胞或組織中［12］;最后，就利用放射性自顯影技術對其進行鑒定。

2.3.2 分子熒光標記法

鑒定糖基化蛋白最為普遍和最具效率的技術當屬熒光分子標記法，其基本原理是因為一部分的糖蛋白擁有自發光特點，所以能直接采用所檢測的熒光值說明蛋白進行糖基化修飾的程度，熒光值是利用熒光分光計來測量的。

2.3.3 電泳法

最古老對糖蛋白進行鑒定的技術便指電泳法，其包含單、雙向電泳兩種，這兩種技術能夠鑒定出糖蛋白。日常使用親和電泳比色法和SDS-PAGE法對糖基化程度的高低及糖基化中是否發生血紅蛋白的隔離進行鑒定［13］。

2.3.4 凝集素標記法

2.3.5 抗體標記法

抗體標記法是針對糖蛋白所帶糖鏈的類型制備各種抗體，對糖蛋白進行檢測。

2.3.6 化學酵素法

生物學家Khidekel是最早研究此類技術的，他很早便發現了一種叫半乳糖基轉移酶的物質，這種物質的功能非常強大，能使糖蛋白自動地攜帶含酮基的蛋白毒素抗體。

2.4 磷酸化的研究方法及關鍵技術

如今，在對磷酸化肽和磷酸化蛋白質的探究中，對它們之間富集、分離及檢測所采用的技術非常之多，在此主要介紹四類辦法［14］:

2.4.1 免疫沉淀法

此技術的作用機制是要制備出一種特殊的抗體，它能對所有含磷酸化殘基的蛋白進行免疫沉淀，從而能高效地鑒定磷酸化蛋白。

2.4.2 流式細胞儀

實驗證明，流式細胞儀不僅可以測試轉錄活化基因STAT的活躍性和檢測信號傳導的作用，還能利用它檢測熒光強度，來分析酪氨酸磷酸化蛋白的濃度大小。

2.4.3 雙向凝膠電泳法

現今國際上一般是利用2D凝膠電泳對磷酸化蛋白進行鑒定的，此項技術已經在得到科學家的廣泛認可，及得到普遍的應用。

2.4.4 固相金屬親和色譜

研究發現，這種方法最開始是被應用在磷蛋白進行親和純化的過程中，固相金屬和磷蛋白中的磷酸殘基之間具有不錯吸引力，從而使得這些離子能夠被固定在糖蛋白上，最后利用IMAC柱就可以聚集那些進行磷基化的蛋白質，從而對磷蛋白進行了鑒定。

2.5 酯基化的研究方法及關鍵技術

就當今研究結果而言，所了解到的蛋白酯基化僅有四類:十四酰化、十六酰化、異戊烯化法呢基化、香葉基香葉基化。

生物學家Kho使用了tagging-via-substrate方法［15］，其首先對異戊烯化法呢基團進行加氮處理，并把它添加到已經培養好的小鼠細胞溶液中，利用小鼠細胞進行新陳代謝這一生物功能，把含氮的法呢基團與酯基化作用的靶點相結合。由于異戊烯化法呢基團上的氮基團能夠和被生物素所標記的三芳基膦脂這種物質進行作用，所以最后可以采用對標記物進行鑒定的方法來檢驗脂蛋白是否產生。

2.6 泛素化與SUMO化修飾的研究方法

一般先利用6xHis這種物質對泛素蛋白進行標記處理，再利用螯合親與色譜技術來聚集來檢測泛素化蛋白質。研究發現泛素蛋白的碳尾部為Arg-Gly-Gly的構造［16］，若用胰蛋白酶對它作用并發生降解反應時，Gly-Gly這個基因片段仍仍能夠被保留在泛素蛋白的肽鏈結構上，導致肽鏈基團的基因片段劇增一百多段，后面再利用串聯質譜法來檢測泛素化的作用靶點。

綜上所述，目前所具有的對泛素蛋白探究的技術是非常少的，所具有的類型也很單調。對泛素蛋白的檢測、泛素作用靶點的定位以及泛素蛋白本身性質的探究方法中，這些技術還必須進行不斷的改進和完善。除了泛素化修飾之外，還發現名為類泛素化修飾，類泛素化修飾(SUMO)是泛素化修飾的又一作用類型，它們之間具有顯著的序列同源性，在多數條件下，它們都能夠利用類似的作用機制來促使蛋白共價修飾的形成。現今科學界中，大量的和蛋白泛素化修飾雷同的探索技術也都利用到對類泛素化(Sumoylation)的探究發現中。

3 翻譯后修飾的研究展望

一方面，由于蛋白質的生物學功能不管是對人類還是對動物來說，都有著非常重要的意義，而翻譯后修飾是使蛋白質發揮其重要生物學功能的基石，所以這也是為什么要對此方面問題的討論花費巨大的時間與精力，及研究如此深入。時至今日，在生物界中所發現的翻譯后修飾的種類不計其數，已經記錄在冊的就超過了400多種，并且科學家們還在不斷地探索發現。翻譯后修飾存在時空特異性的特點，主要表現在:若生物的內在狀態發生變化時，翻譯后修飾的種類也會有所改變，其修飾程度還會隨著環境的改變而變化，而且某些修飾還是轉瞬即逝的，因此，定量研究翻譯后修飾及為重要。另一方面，盡管大規模翻譯后修飾蛋白質的研究已經轟轟烈烈的進行，我們采用現有的技術也可以鑒定一定數量的翻譯后修飾蛋白，但是針對整個翻譯后修飾蛋白質組學來講，這些已作的研究很可能只是滄海一粟。因此翻譯后修飾的種類、過程以及其生物學功能還有待于進一步的研究和發現。即便如此，相信隨著科學的發展，這類問題都將迎刃而解，相信在不久的將來，新的翻譯后修飾的作用將會被發現，定量技術的發展應用也會日趨完善，人們對翻譯后修飾蛋白質的認識將更為深刻，這也必將加深人們對蛋白質生物功能多樣性的認識和體內信號網絡通路的理解。

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