Bcl2和HNF3β在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

覃春艷　羅維貴　黃霞　鄧俊華　覃雪梅　蘇慧

【摘要】 目的 探討B(tài)cl2和HNF3β在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義。

方法 應(yīng)用免疫組化法檢測65例非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織中HNF3β和Bcl2的表達(dá)。

結(jié)果 65例非小細(xì)胞肺癌中，Bcl2和HNF3β陽性表達(dá)率分別為78.5%（51/65）和33.8%（22/65），癌旁正常肺組織Bcl2和HNF3β陽性表達(dá)率分別為16.9%（11/65）和84.6% （55/65）；非小細(xì)胞肺癌組織中HNF3β陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常肺組織，Bcl2陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常肺組織，HNF3β和Bcl2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P<005）；HNF3β低表達(dá)和Bcl2高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌TNM臨床分期、病理組織類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存期呈顯著相關(guān)（P<005或<001）。

結(jié)論 HNF3β和Bcl2在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要作用，推測HNF3β和Bcl2蛋白表達(dá)可共同作為非小細(xì)胞肺癌早期診斷、預(yù)后評估生物標(biāo)志物，可作為肺癌預(yù)后的一個適用新靶點。

【關(guān)鍵詞】 非小細(xì)胞肺癌；HNF3β；Bcl2；免疫組化

中圖分類號：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：10031383（2014）02014105

DOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.02.003

Expression and clinical significance of Bcl2 and HNF3β in nonsmall cell lung cancer

[HJ2][HJ]

QIN Chunyan，LUO Weigui▲，HUANG Xia，DNEG Junhua，QIN Xuemei，SU Hui

（Department of Respiratory，the Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000，Guangxi， China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】 Objective To investigate the expression and clinical significance of Bcl2 and HNF3β in nonsmall cell lung cancer （NSCLC）.

Methods Immunohistochemistry was used to test the expressions of Bcl2 and HNF3β in the NSCLC and adjacent normal lung tissue of 65 cases.

Results The positive expression rates of Bcl2 and HNF3β in the NSCLC of all patients were 78.5%（51/65） and 33.8%（22/65） respectively and those in the adjacent normal lung tissue were 16.9%（11/65）and 84.6%（55/65），respectively.The positive expression rate of HNF3β in NSCLC tissue was significantly lower than that in the adjacent normal lung tissue，while the positive expression rate of Bcl2 in NSCLC tissue was significantly higher than that of the adjacent normal lung tissue.The protein expressions of HNF3β and Bcl2 were negatively correlated（P<005）.The low expression of HNF3β and high expression of Bcl2 were significantly correlated to TNM clinical stage，pathological types，with or without cervical lymph node metastasis and patients lifetime of NSCLC（P<005 or 0.01）.

Conclusion Bc2 and HNF3β play a very important role in the occurrence and progress of NSCLC. Speculation of the protein expression of Bcl2 and HNF3β may become biomarkers in early diagnosis and prognostic evaluation of NSCLC，which can be used as a suitable new target for lung cancer prognosis.

【Key words】 nonsmall cell lung cancer；HNF3β；Bcl2；immunohistochemistry

肺癌是全世界發(fā)生率最高的惡性腫瘤，其病死率亦位居所有惡性腫瘤的首位，盡管人們對其采用了積極和有效的防治措施，但發(fā)病率、病死率依然居高不下，為提高肺癌的早期診斷率和治療有效率，降低病死率，尋找與肺癌的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的影響因素，特別是肺癌的凋亡相關(guān)基因及抑癌基因，已經(jīng)成為肺癌分子生物學(xué)研究的前沿知識和重點課題。Bcl2基因發(fā)現(xiàn)較早，已經(jīng)在多種腫瘤中得到研究，在肺癌發(fā)病中所起的作用亦取得一定的研究成效。而肝細(xì)胞核因子3β（hepatocyte nuclear factor，HNF3β or Foxa2）作為一種抑癌基因，其在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用地位近期日益受到人們的關(guān)注。HNF3β和Bcl2兩者在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的地位及相互作用，迄今尚未見文獻(xiàn)報道。本研究旨在探討HNF3β和Bcl2在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及其臨床意義，為基礎(chǔ)研究和肺癌的靶向治療及預(yù)后提出指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2006年12月～2012年12月在我院外科手術(shù)切除的65例經(jīng)病理確診為NSCLC患者的組織標(biāo)本為實驗組，對照組為與其相應(yīng)的距離癌組織5 cm以上的正常肺組織標(biāo)本，65例患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或靶向治療。65例非小細(xì)胞肺癌中，男41例，女24例，年齡為37～75歲，平均年齡為55.7歲；其中鱗癌36例，腺癌24例，其他5例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期患者47例，Ⅲ期患者18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；獲隨訪者51例，隨訪率為78.5% （51/65），隨訪時間5個月～5年，平均隨訪35.4個月。

1.2 方法

手術(shù)獲取的所有新鮮標(biāo)本均即時用10%多聚甲醛溶液固定，用石蠟包埋制作保存，組織蠟塊進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片后固定于載玻片上。切片厚度4 μm分別行HE染色和免疫組化染色。取已知陽性的切片做對照模板，用PBS代替做陰性對照模板。兔抗人Bcl2單克隆抗體（SP21）和兔抗人HNF3β單克隆抗體及相應(yīng)試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑盒均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.3 結(jié)果判斷

染色結(jié)果呈棕黃色和棕褐色顆粒為Bcl2和HNF3β陽性信號，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，染色結(jié)果呈棕黃色和棕褐色是Bcl2和HNF3β蛋白陽性表達(dá)區(qū)間。隨機選取高倍鏡下（×400）10個不同視野，各計數(shù)300個細(xì)胞。顯色度按細(xì)胞著色計分：無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分比按4級計分：<5%為0分， 5%～24%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。2項計分相加，0分為（-），1～4分為（+）；>4分為（++）。取兩者評分之和的數(shù)值作為結(jié)果判定，即染色強度與陽性細(xì)胞數(shù)百分比之和，陽性為>2分，陰性為0～2分。免疫組化染色結(jié)果采用雙盲法測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，進(jìn)行t檢驗；P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl2和HNF3β在非小細(xì)胞肺癌及正常組織中的表達(dá)

在非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常組織中，Bcl2蛋白陽性（見圖1）表達(dá)率分別為78.5%（51/65）和16.9%（11/65）；HNF3β陽性（見圖2）表達(dá)率分別為33.8%（22/65）和84.6%（55/65）。Bcl2在非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)，在正常肺組織中低表達(dá)，而HNF3β則與之相反，兩者陽性表達(dá)率之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）。見表1。

2.2 Bcl2和HNF3β與臨床、病理特征的關(guān)系

Bcl2和HNF3β的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史無關(guān)（P>0.05） 。Bcl2的陽性表達(dá)率與臨床分期、病理組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P<005或001），與分化程度無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P>0.05）；HNF3β陽性表達(dá)率與臨床分期、分化程度、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，呈明顯負(fù)相關(guān)（P<005）。見表2。

2.3 Bcl2與HNF3β蛋白表達(dá)的相關(guān)性

通過比較分析資料，在非小細(xì)胞肺癌中，隨著Bcl2陽性表達(dá)的增強，HNF3β陽性表達(dá)則相應(yīng)減弱，兩者之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），在NSCLC中HNF3β和Bcl2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。見表3。

2.4 Bcl2和 HNF3β表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

獲隨訪的51例非小細(xì)胞肺癌患者中，其中Bcl2表達(dá)為強陽性18例，其術(shù)后1、3、5年的生存率為77.8%（14/18）、444%（8/18）和222%（4/18），而28例Bcl2弱陽性和陰性表達(dá)的患者1、3、5年生存率分別為89.3%（25/28）、75%（21/28）和53.6%（15/28），Bcl2強陽性者1、3、5年生存率顯著下降（P<005）。而6例HNF3β強陽性者中，1、3、5年生存率均為99.8%，HNF3β弱陽性表達(dá)或陰性的40例患者，其1、3、5 年生存率分別為82.5%（33/40）、47.5%（19/40）、30.0%（12/40），呈明顯下降（P<005）。

3 討 論

Bcl2基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子，它由Tsujimoto于1984年首先發(fā)現(xiàn)并報道[1]。Bcl2基因位于18q21.3染色體上，由三個外顯子、兩個啟動子和一個內(nèi)含子構(gòu)成，它在正常情況下不表達(dá)或低表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl2基因家族成員有兩大類，一類是促細(xì)胞凋亡的，家族成員主要包括 Bax、Bik、Bclxs、Bid、Bak和Bad，以及參與細(xì)胞存活的LMW5HL等；另一類是抗細(xì)胞凋亡的，他們主要定位在細(xì)胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，包括Bcl2、BclxL、Mcl1、Bclw、BHRF1和線蟲Ced9等[2]。其抑制細(xì)胞凋亡的機制為：Bcl2利用線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)來改變膜電位，質(zhì)子通過選擇性通道從線粒體膜轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，同時抑制細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，最后抑制促進(jìn)細(xì)胞生存所必需的接頭蛋白，阻斷導(dǎo)致細(xì)胞最終裂解的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。目前研究觀點表明，對Bcl2蛋白與臨床分期、病理組織特征及臨床預(yù)后的關(guān)系，依然存在較大分歧，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Bcl2的高表達(dá)與肺癌患者分化較好的病理特征和良好預(yù)后有關(guān)，Bcl2可以用于NSCLC患者的預(yù)后分層[3]。本研究結(jié)果顯示，65例正常組織中僅11例Bcl2表達(dá)為陽性，陽性表達(dá)率為16.9%；65例 NSCLC組織中51例表現(xiàn)為陽性，陽性表達(dá)率為78.5%，Bcl2在NSCLC中的陽性表達(dá)與病理組織類型、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其在鱗癌、臨床Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中高表達(dá)，在腺癌、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期的病例中低表達(dá)，前者明顯高于后者，且與患者生存期顯著相關(guān)，本研究得到的結(jié)果與陽諾等人[4]的研究相一致。說明Bcl2基因的過度表達(dá)是肺癌的早期表現(xiàn)，其在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)，與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可用于NSCLC的早期診斷。

HNF3β是HNF3家族三個成員之一，它以單體形式結(jié)合，具有一高度保守的DNA結(jié)合區(qū)即翼旋（winged helix）區(qū)[5]。體外的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，在鱗癌、腺癌、非小細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞系中，其本身胞內(nèi)HNF3β低表達(dá)，且加入HNF3β后，腫瘤細(xì)胞明顯增殖變慢或凋亡，這表明HNF3β是一種很強的肺癌抑制因子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，使用刺激人類肺癌細(xì)胞株后，編碼HNF3β基因的FOXA2蛋白表達(dá)明顯下降，TGFβl可以促進(jìn)腫瘤血管的生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移和免疫抑制的作用，使其與肺癌，尤其是NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系，但其具體機制尚未完全明確[7]。HNF3β抑制肺癌形成過程中的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程，達(dá)到抑制肺癌形成、增殖、擴(kuò)散的目的[8]。本研究提示，HNF3β在正常肺組織陽性表達(dá)率為846%，在非小細(xì)胞肺癌中陽性表達(dá)率為33.8%，其表達(dá)與TNM分期、組織病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，HNF3β在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腺癌及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中，表達(dá)陽性率降低，提示HNF3β在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移中起一定抑制作用。在51例非小細(xì)胞肺癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，HNF3β低表達(dá)的患者，其總體無瘤生存期比HNF3β高表達(dá)者短，提示HNF3β的表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床預(yù)后存在一定的關(guān)系，可作為一種有待于開發(fā)利用于肺癌分期及臨床預(yù)后的標(biāo)志物。

本組研究還發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，Bcl2和HNF3β的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史并無顯著的相關(guān)性（P>0.05） ，大多數(shù)的研究亦發(fā)現(xiàn)雖然Bcl2和HNF3β兩者在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作

用，但其與NSCLC的組織細(xì)胞學(xué)類型、腫瘤大小等的關(guān)系尚未達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)識，其具體機制尚未完全明確，有待進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2006年12月～2012年12月在我院外科手術(shù)切除的65例經(jīng)病理確診為NSCLC患者的組織標(biāo)本為實驗組，對照組為與其相應(yīng)的距離癌組織5 cm以上的正常肺組織標(biāo)本，65例患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或靶向治療。65例非小細(xì)胞肺癌中，男41例，女24例，年齡為37～75歲，平均年齡為55.7歲；其中鱗癌36例，腺癌24例，其他5例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期患者47例，Ⅲ期患者18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；獲隨訪者51例，隨訪率為78.5% （51/65），隨訪時間5個月～5年，平均隨訪35.4個月。

1.2 方法

手術(shù)獲取的所有新鮮標(biāo)本均即時用10%多聚甲醛溶液固定，用石蠟包埋制作保存，組織蠟塊進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片后固定于載玻片上。切片厚度4 μm分別行HE染色和免疫組化染色。取已知陽性的切片做對照模板，用PBS代替做陰性對照模板。兔抗人Bcl2單克隆抗體（SP21）和兔抗人HNF3β單克隆抗體及相應(yīng)試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑盒均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.3 結(jié)果判斷

染色結(jié)果呈棕黃色和棕褐色顆粒為Bcl2和HNF3β陽性信號，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，染色結(jié)果呈棕黃色和棕褐色是Bcl2和HNF3β蛋白陽性表達(dá)區(qū)間。隨機選取高倍鏡下（×400）10個不同視野，各計數(shù)300個細(xì)胞。顯色度按細(xì)胞著色計分：無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分比按4級計分：<5%為0分， 5%～24%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。2項計分相加，0分為（-），1～4分為（+）；>4分為（++）。取兩者評分之和的數(shù)值作為結(jié)果判定，即染色強度與陽性細(xì)胞數(shù)百分比之和，陽性為>2分，陰性為0～2分。免疫組化染色結(jié)果采用雙盲法測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，進(jìn)行t檢驗；P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl2和HNF3β在非小細(xì)胞肺癌及正常組織中的表達(dá)

在非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常組織中，Bcl2蛋白陽性（見圖1）表達(dá)率分別為78.5%（51/65）和16.9%（11/65）；HNF3β陽性（見圖2）表達(dá)率分別為33.8%（22/65）和84.6%（55/65）。Bcl2在非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)，在正常肺組織中低表達(dá)，而HNF3β則與之相反，兩者陽性表達(dá)率之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）。見表1。

2.2 Bcl2和HNF3β與臨床、病理特征的關(guān)系

Bcl2和HNF3β的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史無關(guān)（P>0.05） 。Bcl2的陽性表達(dá)率與臨床分期、病理組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P<005或001），與分化程度無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P>0.05）；HNF3β陽性表達(dá)率與臨床分期、分化程度、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，呈明顯負(fù)相關(guān)（P<005）。見表2。

2.3 Bcl2與HNF3β蛋白表達(dá)的相關(guān)性

通過比較分析資料，在非小細(xì)胞肺癌中，隨著Bcl2陽性表達(dá)的增強，HNF3β陽性表達(dá)則相應(yīng)減弱，兩者之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），在NSCLC中HNF3β和Bcl2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。見表3。

2.4 Bcl2和 HNF3β表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

獲隨訪的51例非小細(xì)胞肺癌患者中，其中Bcl2表達(dá)為強陽性18例，其術(shù)后1、3、5年的生存率為77.8%（14/18）、444%（8/18）和222%（4/18），而28例Bcl2弱陽性和陰性表達(dá)的患者1、3、5年生存率分別為89.3%（25/28）、75%（21/28）和53.6%（15/28），Bcl2強陽性者1、3、5年生存率顯著下降（P<005）。而6例HNF3β強陽性者中，1、3、5年生存率均為99.8%，HNF3β弱陽性表達(dá)或陰性的40例患者，其1、3、5 年生存率分別為82.5%（33/40）、47.5%（19/40）、30.0%（12/40），呈明顯下降（P<005）。

3 討 論

Bcl2基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子，它由Tsujimoto于1984年首先發(fā)現(xiàn)并報道[1]。Bcl2基因位于18q21.3染色體上，由三個外顯子、兩個啟動子和一個內(nèi)含子構(gòu)成，它在正常情況下不表達(dá)或低表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl2基因家族成員有兩大類，一類是促細(xì)胞凋亡的，家族成員主要包括 Bax、Bik、Bclxs、Bid、Bak和Bad，以及參與細(xì)胞存活的LMW5HL等；另一類是抗細(xì)胞凋亡的，他們主要定位在細(xì)胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，包括Bcl2、BclxL、Mcl1、Bclw、BHRF1和線蟲Ced9等[2]。其抑制細(xì)胞凋亡的機制為：Bcl2利用線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)來改變膜電位，質(zhì)子通過選擇性通道從線粒體膜轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，同時抑制細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，最后抑制促進(jìn)細(xì)胞生存所必需的接頭蛋白，阻斷導(dǎo)致細(xì)胞最終裂解的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。目前研究觀點表明，對Bcl2蛋白與臨床分期、病理組織特征及臨床預(yù)后的關(guān)系，依然存在較大分歧，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Bcl2的高表達(dá)與肺癌患者分化較好的病理特征和良好預(yù)后有關(guān)，Bcl2可以用于NSCLC患者的預(yù)后分層[3]。本研究結(jié)果顯示，65例正常組織中僅11例Bcl2表達(dá)為陽性，陽性表達(dá)率為16.9%；65例 NSCLC組織中51例表現(xiàn)為陽性，陽性表達(dá)率為78.5%，Bcl2在NSCLC中的陽性表達(dá)與病理組織類型、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其在鱗癌、臨床Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中高表達(dá)，在腺癌、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期的病例中低表達(dá)，前者明顯高于后者，且與患者生存期顯著相關(guān)，本研究得到的結(jié)果與陽諾等人[4]的研究相一致。說明Bcl2基因的過度表達(dá)是肺癌的早期表現(xiàn)，其在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)，與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可用于NSCLC的早期診斷。

HNF3β是HNF3家族三個成員之一，它以單體形式結(jié)合，具有一高度保守的DNA結(jié)合區(qū)即翼旋（winged helix）區(qū)[5]。體外的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，在鱗癌、腺癌、非小細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞系中，其本身胞內(nèi)HNF3β低表達(dá)，且加入HNF3β后，腫瘤細(xì)胞明顯增殖變慢或凋亡，這表明HNF3β是一種很強的肺癌抑制因子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，使用刺激人類肺癌細(xì)胞株后，編碼HNF3β基因的FOXA2蛋白表達(dá)明顯下降，TGFβl可以促進(jìn)腫瘤血管的生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移和免疫抑制的作用，使其與肺癌，尤其是NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系，但其具體機制尚未完全明確[7]。HNF3β抑制肺癌形成過程中的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程，達(dá)到抑制肺癌形成、增殖、擴(kuò)散的目的[8]。本研究提示，HNF3β在正常肺組織陽性表達(dá)率為846%，在非小細(xì)胞肺癌中陽性表達(dá)率為33.8%，其表達(dá)與TNM分期、組織病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，HNF3β在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腺癌及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中，表達(dá)陽性率降低，提示HNF3β在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移中起一定抑制作用。在51例非小細(xì)胞肺癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，HNF3β低表達(dá)的患者，其總體無瘤生存期比HNF3β高表達(dá)者短，提示HNF3β的表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床預(yù)后存在一定的關(guān)系，可作為一種有待于開發(fā)利用于肺癌分期及臨床預(yù)后的標(biāo)志物。

本組研究還發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，Bcl2和HNF3β的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史并無顯著的相關(guān)性（P>0.05） ，大多數(shù)的研究亦發(fā)現(xiàn)雖然Bcl2和HNF3β兩者在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作

用，但其與NSCLC的組織細(xì)胞學(xué)類型、腫瘤大小等的關(guān)系尚未達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)識，其具體機制尚未完全明確，有待進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2006年12月～2012年12月在我院外科手術(shù)切除的65例經(jīng)病理確診為NSCLC患者的組織標(biāo)本為實驗組，對照組為與其相應(yīng)的距離癌組織5 cm以上的正常肺組織標(biāo)本，65例患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或靶向治療。65例非小細(xì)胞肺癌中，男41例，女24例，年齡為37～75歲，平均年齡為55.7歲；其中鱗癌36例，腺癌24例，其他5例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期患者47例，Ⅲ期患者18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；獲隨訪者51例，隨訪率為78.5% （51/65），隨訪時間5個月～5年，平均隨訪35.4個月。

1.2 方法

手術(shù)獲取的所有新鮮標(biāo)本均即時用10%多聚甲醛溶液固定，用石蠟包埋制作保存，組織蠟塊進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片后固定于載玻片上。切片厚度4 μm分別行HE染色和免疫組化染色。取已知陽性的切片做對照模板，用PBS代替做陰性對照模板。兔抗人Bcl2單克隆抗體（SP21）和兔抗人HNF3β單克隆抗體及相應(yīng)試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑盒均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.3 結(jié)果判斷

染色結(jié)果呈棕黃色和棕褐色顆粒為Bcl2和HNF3β陽性信號，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，染色結(jié)果呈棕黃色和棕褐色是Bcl2和HNF3β蛋白陽性表達(dá)區(qū)間。隨機選取高倍鏡下（×400）10個不同視野，各計數(shù)300個細(xì)胞。顯色度按細(xì)胞著色計分：無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分比按4級計分：<5%為0分， 5%～24%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。2項計分相加，0分為（-），1～4分為（+）；>4分為（++）。取兩者評分之和的數(shù)值作為結(jié)果判定，即染色強度與陽性細(xì)胞數(shù)百分比之和，陽性為>2分，陰性為0～2分。免疫組化染色結(jié)果采用雙盲法測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，進(jìn)行t檢驗；P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl2和HNF3β在非小細(xì)胞肺癌及正常組織中的表達(dá)

在非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常組織中，Bcl2蛋白陽性（見圖1）表達(dá)率分別為78.5%（51/65）和16.9%（11/65）；HNF3β陽性（見圖2）表達(dá)率分別為33.8%（22/65）和84.6%（55/65）。Bcl2在非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)，在正常肺組織中低表達(dá)，而HNF3β則與之相反，兩者陽性表達(dá)率之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）。見表1。

2.2 Bcl2和HNF3β與臨床、病理特征的關(guān)系

Bcl2和HNF3β的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史無關(guān)（P>0.05） 。Bcl2的陽性表達(dá)率與臨床分期、病理組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P<005或001），與分化程度無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P>0.05）；HNF3β陽性表達(dá)率與臨床分期、分化程度、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，呈明顯負(fù)相關(guān)（P<005）。見表2。

2.3 Bcl2與HNF3β蛋白表達(dá)的相關(guān)性

通過比較分析資料，在非小細(xì)胞肺癌中，隨著Bcl2陽性表達(dá)的增強，HNF3β陽性表達(dá)則相應(yīng)減弱，兩者之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），在NSCLC中HNF3β和Bcl2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。見表3。

2.4 Bcl2和 HNF3β表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

獲隨訪的51例非小細(xì)胞肺癌患者中，其中Bcl2表達(dá)為強陽性18例，其術(shù)后1、3、5年的生存率為77.8%（14/18）、444%（8/18）和222%（4/18），而28例Bcl2弱陽性和陰性表達(dá)的患者1、3、5年生存率分別為89.3%（25/28）、75%（21/28）和53.6%（15/28），Bcl2強陽性者1、3、5年生存率顯著下降（P<005）。而6例HNF3β強陽性者中，1、3、5年生存率均為99.8%，HNF3β弱陽性表達(dá)或陰性的40例患者，其1、3、5 年生存率分別為82.5%（33/40）、47.5%（19/40）、30.0%（12/40），呈明顯下降（P<005）。

3 討 論

Bcl2基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子，它由Tsujimoto于1984年首先發(fā)現(xiàn)并報道[1]。Bcl2基因位于18q21.3染色體上，由三個外顯子、兩個啟動子和一個內(nèi)含子構(gòu)成，它在正常情況下不表達(dá)或低表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl2基因家族成員有兩大類，一類是促細(xì)胞凋亡的，家族成員主要包括 Bax、Bik、Bclxs、Bid、Bak和Bad，以及參與細(xì)胞存活的LMW5HL等；另一類是抗細(xì)胞凋亡的，他們主要定位在細(xì)胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，包括Bcl2、BclxL、Mcl1、Bclw、BHRF1和線蟲Ced9等[2]。其抑制細(xì)胞凋亡的機制為：Bcl2利用線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)來改變膜電位，質(zhì)子通過選擇性通道從線粒體膜轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，同時抑制細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，最后抑制促進(jìn)細(xì)胞生存所必需的接頭蛋白，阻斷導(dǎo)致細(xì)胞最終裂解的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。目前研究觀點表明，對Bcl2蛋白與臨床分期、病理組織特征及臨床預(yù)后的關(guān)系，依然存在較大分歧，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Bcl2的高表達(dá)與肺癌患者分化較好的病理特征和良好預(yù)后有關(guān)，Bcl2可以用于NSCLC患者的預(yù)后分層[3]。本研究結(jié)果顯示，65例正常組織中僅11例Bcl2表達(dá)為陽性，陽性表達(dá)率為16.9%；65例 NSCLC組織中51例表現(xiàn)為陽性，陽性表達(dá)率為78.5%，Bcl2在NSCLC中的陽性表達(dá)與病理組織類型、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其在鱗癌、臨床Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中高表達(dá)，在腺癌、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期的病例中低表達(dá)，前者明顯高于后者，且與患者生存期顯著相關(guān)，本研究得到的結(jié)果與陽諾等人[4]的研究相一致。說明Bcl2基因的過度表達(dá)是肺癌的早期表現(xiàn)，其在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)，與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可用于NSCLC的早期診斷。

HNF3β是HNF3家族三個成員之一，它以單體形式結(jié)合，具有一高度保守的DNA結(jié)合區(qū)即翼旋（winged helix）區(qū)[5]。體外的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，在鱗癌、腺癌、非小細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞系中，其本身胞內(nèi)HNF3β低表達(dá)，且加入HNF3β后，腫瘤細(xì)胞明顯增殖變慢或凋亡，這表明HNF3β是一種很強的肺癌抑制因子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，使用刺激人類肺癌細(xì)胞株后，編碼HNF3β基因的FOXA2蛋白表達(dá)明顯下降，TGFβl可以促進(jìn)腫瘤血管的生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移和免疫抑制的作用，使其與肺癌，尤其是NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系，但其具體機制尚未完全明確[7]。HNF3β抑制肺癌形成過程中的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程，達(dá)到抑制肺癌形成、增殖、擴(kuò)散的目的[8]。本研究提示，HNF3β在正常肺組織陽性表達(dá)率為846%，在非小細(xì)胞肺癌中陽性表達(dá)率為33.8%，其表達(dá)與TNM分期、組織病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，HNF3β在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腺癌及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中，表達(dá)陽性率降低，提示HNF3β在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移中起一定抑制作用。在51例非小細(xì)胞肺癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，HNF3β低表達(dá)的患者，其總體無瘤生存期比HNF3β高表達(dá)者短，提示HNF3β的表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床預(yù)后存在一定的關(guān)系，可作為一種有待于開發(fā)利用于肺癌分期及臨床預(yù)后的標(biāo)志物。

本組研究還發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，Bcl2和HNF3β的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史并無顯著的相關(guān)性（P>0.05） ，大多數(shù)的研究亦發(fā)現(xiàn)雖然Bcl2和HNF3β兩者在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作

用，但其與NSCLC的組織細(xì)胞學(xué)類型、腫瘤大小等的關(guān)系尚未達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)識，其具體機制尚未完全明確，有待進(jìn)一步的研究。