PAB—Gal4—DBD—HA—Twist重組質粒的制備

張志霞　劉萍　何濤

【摘要】 目的：構建人Twist基因的表達載體pAB-Gal4-DBD-HA-Twist，為研究其轉錄調控機制提供實驗工具。方法：重組克隆質粒pcDNA-Flag-Twist用含有特異BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點的引物進行聚合酶鏈反應；對含有兩種酶切位點的目的Twist基因片段和pAB-Gal4-DBD-HA載體進行酶切、分離、回收純化、連接后轉入感受態DH5α中，細菌培養，菌落聚合酶鏈反應、測序鑒定。結果：鑒定結果顯示，Twist基因正確克隆到PAB-Gal4-DBD-HA表達載體，并且轉入了大腸桿菌中。結論：成功構建了人twist基因PAB-Gal4-DBD-HA-Twist表達載體，為進一步研究其表達、調控、作用機制奠定基礎。

【關鍵詞】 轉錄因子； Twist； 基因克隆； 重組質粒

【Abstract】 Objective：To construct PAB-Gal4-DBD-HA-twist recombinant expression plasmid，providing experimental tools to study the transcription regulation.Method：The recombinant plasmid pcDNA-Flag-Twist was detected by polymerase chain reaction （PCR） using primers containing specific BamHⅠ and Hind Ⅲ restriction enzyme site.For the purpose of the Twist gene and pAB-Gal4-DBD-HA vector containing two kinds of enzyme cutting sites were studied by enzyme digestion，separation，recovery and purification，connected and transformed into competent DH5 alpha，they were detected by bacterial culture，colony polymerase chain reaction and sequencing identification.Result：The identification results showed that the twist gene recombinant plasmid was successfully constructed and transformed in E.coli.Conclusion：Full-length twist is subcloned into pAB-Gal4-DBD-HA vector successfully，and lay the foundation to further study its expression，regulation and mechanism.

【Key words】 Transcriptional factor； Twist； Gene cloning； Recombinant plasmid

First-authors address：Zaozhuang Vocational College，Zaozhuang 277800，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.009

TWIST蛋白是一種新近發現的轉錄因子，在胚胎發育中起關鍵調控作用[1]。隨后的研究發現，其能與靶基因上的特異DNA序列結合，廣泛參與調控器官生長發育、細胞的凋亡、腫瘤發生、細胞增殖分化等過程[2]。Twist基因是一個候選癌基因，能通過干擾p53相關的通路、抑制p21wafl、干擾NF-KB通路、直接抑制p65，干擾NF-KB的轉錄激活作用等多種途徑抑制細胞凋亡[3-8]。Sosic等[7]研究發現，在生理情況下，TWIST蛋白不但在胚胎發育上扮演重要的角色，而且可以通過活化NF-kB途徑抑制細胞因刺激而產生更多的細胞因子而造成對細胞的損傷[1]。同時，此基因的高表達可以使E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達缺失，促進間質-上皮轉變（MET）而使惡性腫瘤獲得或浸潤、轉移力增強[2]。由此可見，對于twist基因轉錄調控作用的研究是揭示其眾多生理、病理功能的重要基礎。目前，研究基因調控功能的方法之一就是構建待研究基因的表達載體。利用此研究思路，筆者嘗試構建含有twist基因與Gal4-DNA結合區序列的PAB-Gal4-DBD-HA-Twist表達載體，來研究此基因表達調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA-Flag-twist和pAB-Gal4-DBD-HA由美國貝勒醫學院徐建明博士贈予；DH5α由瀘州醫學院醫學分子生物學實驗室保存。BamHⅠ和HindⅢ、DNA mark（DL2000、100 bp DNA Ladder）、TaKaRa LA Taq with GC Buffer PCR試劑盒、質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶購自普洛麥格（北京）生物技術公司；溴化乙錠（EB）購自Sigma公司，酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖購自上海生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增

1.2.1.1 帶有酶切位點BamHⅠ和Hind Ⅲ的TWIST基因片段的獲得 （1）擴增模版：pcDNA-Flag-Twist質粒。（2）引物設計：上游引物P1：5-GTTGGATCCAATGATGCAGGACGTGTCC-3；下游引物P2：5-TTAAAGCTTGTGGGACGCGGACATGGA-3。P1中GTT為保護堿基，GGATCC為BamHⅠ酶切位點，P2中TTA為保護堿基，AAGCTT為Hind Ⅲ酶切位點。擴增片段長度為650 bp（不含引入的酶切位點和保護堿基）。引物經BLAST分析，與Genebank數據庫中其他基因沒顯著同源性，最后送上海生物工程有限公司合成。endprint

1.2.1.2 PCR擴增 反應體系：2×GCBufferⅠ 25 μL，dNTP mixture 8 μL，引物P1和P2各1 μL，TaKaRa LA Taq 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。在PCR擴增儀上進行反應：94 ℃條件下進行預變性 1 min，然后按94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，反應30個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠回收目的條帶。

1.2.2 重組表達載體的構建 PCR產物純化后與質粒pAB-Gal4-DBD-HA用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ于37 ℃ 2 h分別進行雙酶切，酶切產物經凝膠電泳后回收純化，按照T4 DNA連接系統說明進行連接反應。反應體系如下：10×biolabs buffer 2 μL，Twist基因0.5μL，線性pAB-Gal4-DBD-HA 0.7 μL，T4連接酶0.5 μL，ddH2O 16.3 μL，總體系20 μL，將上述反應體系室溫放置15 min。將連接產物通過熱休克法轉化至感受態DH5α，37 ℃150 rpm搖床復蘇培養45 min。取菌液均勻涂布于含終濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素LB瓊脂板上，37 ℃恒溫箱中倒置培養過夜。

1.2.3 重組體的篩選和鑒定

1.2.3.1 菌落PCR篩選重組體 隨機挑取數個菌落，做好標記，菌落聚合酶鏈法篩選重組體，按上述體系和條件反應；根據結果，挑取陽性克隆的另半個菌落至LB培養液中，37 ℃培養過夜。

1.2.3.2 質粒的提取酶切鑒定 按照質粒的提取試劑盒提取質粒，進行雙酶切鑒定。Twist基因通過BamHⅠ和HindⅢ酶切位點進入載體pAB-Gal4-DBD-HA，雙酶切后將會有約4500 bp、650 bp兩個大、小片段。酶切體系如下：10×NE buffer 1μL，10×BSA 1μL，pAB-Gal4-DBD-HA-Twist 3μL，BamH Ⅰ 0.25 ?L，Hind Ⅲ 0.25 μL，雙蒸水 4.5μL。總反應體系為10 ?L，37 ℃培養孵育1 h。

1.2.3.3 測序鑒定 初步鑒定陽性的克隆質粒送上海生工進行序列測定。

2 結果

2.1 pcDNA-Flag-Twist質粒PCR擴增結果 以pcDNA-Flag-Twist為模板，用特異性引物經聚合酶鏈擴增后，電泳檢測為大小約650 bp的片段，與目的片段大小相符（圖1）。

2.2 菌落PCR法鑒定pAB-Gal4-DBD-HA-Twist結果 pAB-Gal4-DBD-HA-Twist連接產物轉化至DH5α，菌落PCR法擴增表達質粒，經凝膠電泳之后，結果與預期結果一致（圖2）。

2.3 重組表達載體的雙酶切鑒定 構建的pAB-Gal4-DBD-HA-Twist用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后出現兩條片段，分別為pAB-Gal4-DBD-HA載體和twist片段，可初步鑒定此克隆為陽性（圖3）。

2.4 表達質粒pAB-Gal4-DBD-HA-Twist測序結果與分析 初步鑒定為陽性克隆的pAB-Gal4-DBD-HA-Twist送上海生工公司測序，結果分析顯示，重組質粒中的twist基因序列與基因庫中公布的已知序列（NM_000474）完全匹配（圖4）。表明目的基因序列按照預期方式定向插入表達載體，成功構建了重組表達載體。

3 討論

Twist基因首先在果蠅中被發現，隨后相繼在其他脊椎動物中發現，脊椎動物的twist基因具有84%～100%的同源性[9-10]。其在幼稚中胚層細胞和中胚層起源器官中表達最多，而在出生后降至低水平，廣泛參與眾多生理、病理過程，它的信號通路是一個復雜、多途徑的網絡系統，是多種與腫瘤發生發展相關途徑的中心環節[1，7，11]。Twist基因的轉錄水平與腫瘤的惡性程度、臨床病理分期分級和轉移能力有關，Twist基因促進了EMT的進程，增加了惡性腫瘤的轉移與侵襲力，其上調表達與紫杉醇和/或長春新堿的耐藥性有關[2，11-13]。

在本研究中，筆者采用HA作為目的基因的連接蛋白，其不會干擾標記蛋白的正常功能，而且可以任意加到目標蛋白的C-或N-末端。含有twist與Gal4-DNA結合區序列融合形成嵌合基因的重組表達質粒構建路線如圖5所示。該質粒可以在細胞內表達出TWIST-Gal4-DBD融合蛋白，利用該蛋白的Gal4-DBD可以與報告基因的啟動子結合的特性，使TWIST蛋白能夠結合于報告基因的附近，對下游靶基因發揮轉錄調控作用。pAB-Gal4-DBD-HA具有很強的復制能力，可以滿足宿主細胞分裂時跟隨胞漿穩定的遺傳給子代細胞，保證了目的基因的表達，此載體還含有高效SV40增強子，能順式調控基因轉錄活性。

因此，該重組質粒的成功構建可以用于在活細胞自然狀態下觀察Twist的基因表達功能，為后續的其功能和臨床的研究奠定了實驗基礎。

參考文獻

[1] Castanon I，Baylies M K.A Twist in fate：evolutionary comparison of Twist structure and funetion[J].Gene，2002，287（1-2）：11-22.

[2] Thisse B，Messa1 M，Perrin-Schmitt F.The twist gene：isolation of a drosophila zygotic gene necessary for the establishment of dorsoventra1 pattern[J].Nucleic Acids Res，1987，15（8）：3439-3452.endprint

[3] Valsesia-Wittmann S，Magdeleine M，Dupasquier S，et al.Oncogenic cooperation between H-Twist and N-Myc overrides failsafe programs in cancer cells[J].Cancer Cell，2004，6（6）：625-630.

[4] Stasiopoulos I A，Mironchik Y，Raman A，et al.HOXA5-twist interaction alters p53 homeostasis in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2005，280（3）：2294-2299.

[5] Hock K，Rimm D L，Williams K R，et al.Expression profiling reveals novel pathways in the transformation of melanocytes to melanomas[J].Cancer Res，2004，64（15）：5270-5282.

[6] Sosic D，Olson E N.A new twist on twist-modulation of the NF-kappa B pathway[J].Cell Cycle，2003，2（2）：76-78.

[7] Sosic D，Richardson J A，Yu K，et al.Twist regulates cytokine gene expression through a negative feedback loop that represses NF-kappaB activity[J].Cell，2003，112（2）：169-180.

[8] Pahl H L.Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors[J].Oncogene，1999，18（49）：6853-6866.

[9] Puisieux A，Valsesia Wittmann S，Ansicau S，et al.A twist for survival and cancer progression[J].Br J Cancer，2006，94（1）：13-17.

[10] Yang J，Mani S A，Donaher J L，et al.Twist，a master regulator of morphogenesis， plays an essential role in tumor metastasis[J].Cell，2004，117（7）：927-939.

[11] Entz-Werle N，Stoetzel C，Berard-Marec P，et al.Frequent genomic abnormalities at TWIST in human pediatric osteosarcomas[J].Int J Cancer，2005，117（3）：349-355.

[12] Kyo S，Sakaguchi J，Ohno S，et al.High Twist expression is involved in infiltrative endometrial cancer and affects patient survival[J].Hum Pathol，2006，37（4）：431-438.

[13] Wang X，Ling M T，Guan X Y，et al.Identification of a novel function of TWIST，a bHLH protein，in the development of acquired taxol resistance in human cancer cells[J].Oncogene，2004，23（2）：474-482.

（收稿日期：2014-04-04） （本文編輯：歐麗）endprint

[3] Valsesia-Wittmann S，Magdeleine M，Dupasquier S，et al.Oncogenic cooperation between H-Twist and N-Myc overrides failsafe programs in cancer cells[J].Cancer Cell，2004，6（6）：625-630.

[4] Stasiopoulos I A，Mironchik Y，Raman A，et al.HOXA5-twist interaction alters p53 homeostasis in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2005，280（3）：2294-2299.

[5] Hock K，Rimm D L，Williams K R，et al.Expression profiling reveals novel pathways in the transformation of melanocytes to melanomas[J].Cancer Res，2004，64（15）：5270-5282.

[6] Sosic D，Olson E N.A new twist on twist-modulation of the NF-kappa B pathway[J].Cell Cycle，2003，2（2）：76-78.

[7] Sosic D，Richardson J A，Yu K，et al.Twist regulates cytokine gene expression through a negative feedback loop that represses NF-kappaB activity[J].Cell，2003，112（2）：169-180.

[8] Pahl H L.Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors[J].Oncogene，1999，18（49）：6853-6866.

[9] Puisieux A，Valsesia Wittmann S，Ansicau S，et al.A twist for survival and cancer progression[J].Br J Cancer，2006，94（1）：13-17.

[10] Yang J，Mani S A，Donaher J L，et al.Twist，a master regulator of morphogenesis， plays an essential role in tumor metastasis[J].Cell，2004，117（7）：927-939.

[11] Entz-Werle N，Stoetzel C，Berard-Marec P，et al.Frequent genomic abnormalities at TWIST in human pediatric osteosarcomas[J].Int J Cancer，2005，117（3）：349-355.

[12] Kyo S，Sakaguchi J，Ohno S，et al.High Twist expression is involved in infiltrative endometrial cancer and affects patient survival[J].Hum Pathol，2006，37（4）：431-438.

[13] Wang X，Ling M T，Guan X Y，et al.Identification of a novel function of TWIST，a bHLH protein，in the development of acquired taxol resistance in human cancer cells[J].Oncogene，2004，23（2）：474-482.

（收稿日期：2014-04-04） （本文編輯：歐麗）endprint

[3] Valsesia-Wittmann S，Magdeleine M，Dupasquier S，et al.Oncogenic cooperation between H-Twist and N-Myc overrides failsafe programs in cancer cells[J].Cancer Cell，2004，6（6）：625-630.

[4] Stasiopoulos I A，Mironchik Y，Raman A，et al.HOXA5-twist interaction alters p53 homeostasis in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2005，280（3）：2294-2299.

[5] Hock K，Rimm D L，Williams K R，et al.Expression profiling reveals novel pathways in the transformation of melanocytes to melanomas[J].Cancer Res，2004，64（15）：5270-5282.

[6] Sosic D，Olson E N.A new twist on twist-modulation of the NF-kappa B pathway[J].Cell Cycle，2003，2（2）：76-78.

[7] Sosic D，Richardson J A，Yu K，et al.Twist regulates cytokine gene expression through a negative feedback loop that represses NF-kappaB activity[J].Cell，2003，112（2）：169-180.

[8] Pahl H L.Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors[J].Oncogene，1999，18（49）：6853-6866.

[9] Puisieux A，Valsesia Wittmann S，Ansicau S，et al.A twist for survival and cancer progression[J].Br J Cancer，2006，94（1）：13-17.

[10] Yang J，Mani S A，Donaher J L，et al.Twist，a master regulator of morphogenesis， plays an essential role in tumor metastasis[J].Cell，2004，117（7）：927-939.

[11] Entz-Werle N，Stoetzel C，Berard-Marec P，et al.Frequent genomic abnormalities at TWIST in human pediatric osteosarcomas[J].Int J Cancer，2005，117（3）：349-355.

[12] Kyo S，Sakaguchi J，Ohno S，et al.High Twist expression is involved in infiltrative endometrial cancer and affects patient survival[J].Hum Pathol，2006，37（4）：431-438.

[13] Wang X，Ling M T，Guan X Y，et al.Identification of a novel function of TWIST，a bHLH protein，in the development of acquired taxol resistance in human cancer cells[J].Oncogene，2004，23（2）：474-482.

（收稿日期：2014-04-04） （本文編輯：歐麗）endprint