液質聯用法監測癲癇患兒卡馬西平血藥濃度及結果分析

曲素欣 陳湛芳

癲癇是生活中最為常見的慢性驚厥性疾病，患病率約為3‰～6‰。患者在發病時，自腦部病灶發出一種異常的高頻放電，并向病灶周圍正常腦組織擴散，激發腦細胞廣泛的興奮，從而出現特有的驚厥癥狀，并伴有運動、感覺、意識、行為、植物神經等方面功能障礙[1-2]。大多數癲癇患者起病于兒童時期。近年來由于小兒癲癇基礎與臨床研究的不斷深入及有關知識的普及，使大多數患兒得到了正規治療，約80%的患兒可獲完全控制，其中大部分能正常生活和學習。小兒癲癇根據病因可分為三類：特發性（原發性）癲癇；癥狀性（繼發性）癲癇；隱源性癲癇。在癲癇發作的治療中，抗癲癇藥物有特殊重要的意義[3]。抗癲癇藥物可通過兩種方式來消除或減輕癲癇發作，一是影響中樞神經元，以防止或減少他們的病理性過度放電；二是提高正常腦組織的興奮閾，減弱病灶興奮的擴散，防止癲癇復發[4]。一般將60年代前合成的抗癲癇藥如：苯妥英鈉、卡馬西平、乙琥胺、丙戊酸鈉等稱為老抗癲癇藥，其中苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉是目前廣泛應用的一線抗癲癇藥[5]。臨床上使用的大多數抗癲癇藥物，均需要進行治療藥物監測（TDM）。血清抗癲癇藥物的監測方法很多，目前以免疫測定法、高效液相色譜法（HPLC）[6-7]，氣相色譜與陰離子化質譜儀（GC/NICI-MS）聯用和高效液相色譜與電噴霧離子化雙極質譜儀（LC/ESI-MS/MS）聯用較為常用[8-9]。本文采用卡馬西平作為研究藥物，卡馬西平（酰胺昧嗪，Cabamazepine，CBZ）為一線廣譜抗癲癇藥物，是治療癲癇全身或局部性大發作的首選藥物[10]。雖然該藥物臨床療效已基本確定且服用者沒有認知功能方面的不良反應，但由于藥物動力學過程存在明顯的個體差異，且其治療窗較窄（4～12 mg/L）[11]，臨床容易發生皮疹、白細胞減少、肝損害等不良反應。因此，監測卡馬西平的血漿濃度并對其實施個體化給藥是臨床安全用藥的保障。今采集168例本院神經內科門診確診的癲癇患兒，使用高效液相色譜質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）方法進行血藥濃度監測，并進行結果分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取經本院小兒神經內科門診確診的癲癇患者168例，其中男102例，女66例，年齡3～14歲，平均8.5歲，平均體重30 kg。所有患者的確診均以病歷、腦電圖及臨床發作表現、部分患者結合CT為依據。癲癇發作類型參照國際抗癲癇聯盟（ILAE）2001年修訂的癲癇發作分類法：112例全面性發作，39例為單純局灶性發作，17例為難以分類的復雜部分發作。全部患者一月內未服用抗癲癇藥，一周內未服用任何其他藥物。經體檢，血常規、血小板、出凝血時間、肝腎功能、生化檢查及心電圖均正常。實驗前兩周至整個實驗過程未用過任何其他藥物，且所有取樣患者均簽署了知情協議。

1.2 試劑與儀器 卡馬西平對照品購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水選用超純水。

質譜儀為ISQQuantum Discovery MAX質譜儀（美國Thermo Finnigan公司），液相色譜儀為Agilengt 1100型液相色譜儀，配備Agilent EZChrom軟件進行數據處理，并配有自動進樣器、紫外檢測器、電噴霧離子源。

1.3 卡馬西平對照品溶液的配制 精密稱取適量卡馬西平，加甲醇溶液稀釋制成0.1 mg/L的卡馬西平溶液作為標準液儲備使用。

1.4 血樣處理 取血清100 μL置于0.5 mL離心管中，加入甲醇200 μL混勻并渦旋1 min，10000轉/min進行離心5 min，取上清液60 ℃水浴中N2吹干，用甲醇200 μL溶解混勻并渦旋1 min，10000轉/min進行離心5 min，然后取離心上清液10 μL進樣。

1.5 色譜及質譜條件 色譜柱：Waters C18（150 mm×2.1 mm，5 um）；流動相：甲醇-0.1%醋酸銨溶液（40∶60），流速為0.3 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長280 nm。

質譜條件：ESI掃描范圍100～600 amu；毛細管電壓：4 kV；鞘氣：30 rab，輔氣：10 rab；毛細管溫度：350 ℃；采用正離子掃描模式，分別進行一級質譜全掃描和選擇離子。

2 結果

2.1 專屬性試驗 見圖1。從圖1可見卡馬西平與內源性物質分離良好。

圖1 試樣典型色譜

2.2 線性范圍 取空白血清1.0 mL，加入卡馬西平貯備液適量，依次配制成濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0、40.0 mg/L的樣品繪制標準曲線。以待測物濃度X為橫坐標，待測物峰面積Y為縱坐標進行回歸運算，求得直線回歸方程為Y=209X+2.09×105（相關系數r=0.9967），卡馬西平血藥濃度在位于2.0～40.0 mg/L區間范圍內線性關系良好，下限為2.0 mg/L。

2.3 精密度試驗 取空白血清，加入卡馬西平貯備液配成血藥濃度為4.0、10.0、20.0 mg/L的血清樣品各5份，于同1 d內進樣5次測定，求得日內RSD。連續測定5 d，求得日間RSD。數據見表1。

2.4 回收率試驗 取空白血清，加入卡馬西平貯備液配成血藥濃度為4.0、10.0、20.0 mg/L的血清樣品各5份，用隨行的標準曲線回歸方程計算樣品濃度，并以測定值的平均值與配制的理論濃度比較，計算得相對回收率。由血清樣品測得的峰面積與相同濃度卡馬西平對照品溶液測得峰面積之比，計算絕對回收率。結果見表1。

表1 卡馬西平的精密度與回收率 %

圖2 卡馬西平質譜掃描圖

2.6 患者血藥濃度測定 168例卡馬西平血藥濃度監測結果比較：以卡馬西平血藥濃度正常范圍為4～12 mg/L，將結果按照不同濃度范圍分為3組，見表2。

168例癲癇患者中有104例的CBZ血藥濃度為4～12 mg/L，其中81例顯效或有效、22例效果不明顯，有效率為77.9%。48例患者的CBZ血藥濃度<4 mg/L，占全部患者28.6%，其中15例患者有效，其余無效；16例患者的CBZ血藥濃度>12 mg/L全部有效，但有4例患者發生了頭暈、乏力、震顫、疊影等不良反應，在調整給藥劑量后癥狀逐漸減輕，3 d后相應癥狀完全消失。

表2 168例次卡馬西平血藥濃度測定結果

3 討論

治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）是一門新興邊緣科學，其目的是通過測定血中藥物濃度并利用藥代動力學原理和公式，使給藥方案個體化，以提高療效，避免或減少中毒；同時也為藥物過量、中毒診斷和處理提供理論依據。癲癇藥物TDM是臨床醫學上最先進最活躍的也是最有成效的領域[12]。在此之前，治療是經驗性的，而開展以后，醫生能積極主動地以藥代動力學的觀點去制定和調整用藥方案，以提高抗癲癇藥物治療的安全性，避免對機體造成危害。

卡馬西平血藥濃度在大于12 mg/L時，其治療有效率大大提高，這充分說明了治療效果不佳時，患者應重視血藥濃度監測[13]。此外，在結果高于治療濃度范圍的高限時，亦有服用丙戊酸鈉患者效果不好，提示醫師應該換藥或聯合用藥。而卡馬西平不出現此情況，是否與例數太少有關，值得進一步探討。但由于卡馬西平較大的毒性，患者應在醫師的指導下，在控制病情的前提下，降低血藥濃度，以減少不良反應。

在臨床對癲癇患者進行聯合用藥時，由于藥物的相互作用，時常出現干擾藥物監測結果及療效的判斷。因此在進行聯合用藥應增加監測次數，以防劑量不足所致無效或劑量過剩致中毒。本研究168例患者中有104例血藥濃度位于4～12 mg/L的正常范圍，約占60.5%。總體來看雖然此數據與文獻報道略有差異[14]，但造成這種差異的原因可能與卡馬西平的個體用藥差異有關。劑量與穩態血藥濃度之間的關系存在明顯的個體差異。臨床醫師并不十分清楚每位患者治療前所需要維持的最低有效血藥濃度，所以進行血藥濃度監測可以幫助患者找出最佳控制濃度，以達到最佳療效并縮小不良反應至最小[15]。

本組中所采用的LC-MS液譜質譜聯用法具有專屬性強、靈敏度和準確度高等優點，將傳統上測定藥物制劑含量只限于大劑量、高濃度的視野轉移至小劑量、低濃度、高精度的檢測方向上來，用一種更為精確的質量分析方法來服務于藥物制劑含量的測定。該方法的定量下限已達到2.0 mg/L，可較為有效地滿足臨床測定血藥濃度的要求。

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