蘆薈-丹參復(fù)方凝膠對痤瘡主要致病菌的體外抑菌研究

李曉梅 秦桂美

痤瘡是一種皮脂腺的慢性皮膚疾病，痤瘡的主要致病菌是痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌，目前抗痤瘡藥物活性評價主要考察對這兩種菌的抑菌作用[1]，丹參酮對痤瘡的治療已有系統(tǒng)評價[2]，蘆薈在抗炎、消菌、美容方面的藥理作用已有報道[3]。治療痤瘡的常規(guī)劑型有軟膏劑、霜劑、洗劑、擦劑等，但臨床應(yīng)用有多種不足，而外用凝膠劑為透明半固體，質(zhì)地均勻細膩，展開后容易涂布，涂布在皮膚上能形成透明的薄膜，附著性強，釋藥快，滯留時間長，無氣悶，油膩感，易洗除，不污染衣物，對皮膚和黏膜無刺激性，適合痤瘡治療，以此為依據(jù)，與蘆薈提取物蘆薈多糖配制成復(fù)方凝膠，并系統(tǒng)考察其體外抑菌活性，擬為痤瘡的治療提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 凝膠制備材料 中藥材蘆薈為市售品；丹參酮（含量65%），上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；甲硝唑注射液，山東長富潔晶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號09092571；阿莫西林分散片，中諾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號09117005；其他試劑均為分析純。

1.1.2 供試菌株 痤瘡丙酸桿菌，Propionibacterium acnes，G+，購于廣東微生物所；金黃色葡萄球菌，Staphyloccus aureus，G+，由山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基用于痤瘡丙酸桿菌的培養(yǎng)，營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯用于金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆薈多糖提取、精制及含量測定 采用水提醇沉法提取蘆薈多糖，得到蘆薈多糖粗品，透析法精制蘆薈多糖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行含量測定[4]。

1.2.2 菌懸液的制備 將金黃色葡萄球菌分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將痤瘡丙酸桿菌接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)罐中培養(yǎng)。一般接種量為每毫升藥液含103～105個細菌。18～24 h后取出，利用平板培養(yǎng)計數(shù)法將各菌液的濃度稀釋至107～108CFU/mL備用[5]。

1.2.3 供試藥的制備

1.2.3.1 凝膠基質(zhì)制備 按照卡波姆含量0.6%，甘油含量15%，丙二醇含量3%的比例配制卡波姆凝膠500 g 備用[6]。

1.2.3.2 供試凝膠制備 蘆薈多糖600 mg，丹參酮600 mg，加入凝膠基質(zhì)混勻制成復(fù)方方一20 g；蘆薈多糖800 mg，丹參酮400 mg，加入凝膠基質(zhì)混勻制成復(fù)方方二20 g；蘆薈多糖提取物400 mg，丹參酮800 mg，加入凝膠基質(zhì)混勻制成復(fù)方方三20 g；蘆薈多糖1200 mg，加入凝膠基質(zhì)混勻制成單方方一20 g；丹參酮1200 mg，加入凝膠基質(zhì)混勻制成單方方二20 g。

1.2.4 抑菌圈試驗 用丙二醇稀釋供試凝膠至其飽和濃度，設(shè)置3個用量梯度（4、6、8 μL），放入直徑6 mm的濾紙片浸泡2 h取出自然風(fēng)干，貼于涂布菌液的平板表面。丙二醇做陰性對照，阿莫西林、甲硝唑作陽性對照，未涂布菌液的平板作空白對照。每組設(shè)平行樣三個，結(jié)果取其平均值。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌37 ℃有氧培養(yǎng)，痤瘡丙酸桿菌37 ℃無氧培養(yǎng)。24 h后測量抑菌圈直徑。選出抑菌效果最強的復(fù)方制劑做進一步試驗。

1.2.5 最低抑菌濃度（ minimum inhibition concentration，MIC）試驗 將最優(yōu)復(fù)方凝膠稀釋至3 g/L作為待檢藥液，按表1用無菌吸管分裝液體培養(yǎng)基，吸取待檢藥液1 mL加入第1管，吹吸混勻3次后取5 mL至第2管；混勻后取5 mL加至第3管，以此類推至第8管，混勻后，棄5 mL。第9管不加檢樣，為試驗菌對照管，每組設(shè)三個重復(fù)。接種試驗菌液，每管200 μL。金黃色葡萄球菌37 ℃恒溫培養(yǎng)，痤瘡丙酸桿菌37 ℃無氧培養(yǎng)。24 h后肉眼觀察，以濁度為指標(biāo)檢查試管中有無細菌生長，以不顯示渾濁、完全無細菌生長的那一管的藥液稀釋度作為MIC[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 精制蘆薈多糖含量測定結(jié)果 經(jīng)計算得精制的蘆薈多糖含量為72.82%。

2.2 抑菌圈測定結(jié)果 試驗表明，空白對照未長出菌落，陰性對照未出現(xiàn)抑菌圈，表明培養(yǎng)基與無水乙醇以及培養(yǎng)條件等對抑菌效果測定均無干擾。復(fù)方凝膠對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈直徑大于單方凝膠，復(fù)方方三抑菌圈直徑最大，且三種配方的抑菌圈直徑隨濃度的增大而增大。見表2和見表3。

表1 液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法測定MIC稀釋度 mL

2.3 MIC測定結(jié)果 空白管中培養(yǎng)基澄清，說明培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件對MIC的測定沒有干擾。復(fù)方凝膠對金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌的MIC分別為37.5 mg/L、75 mg/L。見表4。

3 討論

痤瘡丙酸桿菌是人類皮膚毛囊皮脂腺濾泡中最主要的微生物，與金黃色葡萄球菌共同導(dǎo)致痤瘡的發(fā)生，引起炎癥性丘疹、膿包等皮損。用藥物減少皮膚毛囊注：陰性對照為凝膠基質(zhì)。陽性對照為甲硝唑，“-”表示不敏感，抑菌圈直徑<7 mm；“+”表示低敏，抑菌圈直徑7～10 mm；“++”表示中敏，抑菌圈直徑10～15 mm；“+++”表示高敏，抑菌圈直徑15～20 mm；“++++”表示極敏，抑菌圈直徑>20 mm中的痤瘡主要致病菌的數(shù)量是目前治療痤瘡的主要途徑之一[8]。維A酸類和抗生素類是臨床上較常使用的藥物[9]。其中常用的抗生素有紅霉素、甲硝唑等，但隨著抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用，細菌對藥物產(chǎn)生耐藥性，從而影響?zhàn)畀徶委煹男Ч胺€(wěn)定性[10]。蘆薈是含有酚類、多糖及氨基酸等化合物的中藥，對革蘭氏陽性菌有較好抗性，且蘆薈多糖和維生素對人體的皮膚有良好的營養(yǎng)、滋潤、增白作用。丹參制劑中含有隱丹參酮、二氫丹參酮，對體外的葡萄球菌、大腸桿菌、變性桿菌有抑制作用[11-12]。同時丹參酮還具有抗雄激素、溫和的雌激素樣活性和抑制皮脂分泌的作用，可以對痤瘡發(fā)揮綜合治療的效果[13]。實驗結(jié)果表明，蘆薈-丹參復(fù)方凝膠對痤瘡主要致病菌抑菌作用強于單方凝膠，且以1：2配比效果最佳，對金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌的MIC分別為37.5 mg/L和75 mg/L。且蘆薈-丹參復(fù)方凝膠為中藥制劑，杜絕了眾多患者采取西藥治療引起的一系列副作用，細菌一般不產(chǎn)生抗藥性。

表2 不同濃度凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑 mm

表3 不同濃度凝膠對痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈直徑 mm

表4 最優(yōu)復(fù)方凝膠對2種痤瘡致病菌的MIC

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