人源化抗Aβ抗體治療APP/PS1轉基因鼠的實驗研究

馬晉 段金海 鄒俊濤 汪洋

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性記憶力減退和認知障礙為主要臨床特征的中樞神經退行性疾病。研究表明，β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成老年斑是AD病理機制的中心環節。人源化抗Aβ抗體來源于健康人血，制備相對簡單，成本低。本研究采用純化的人源化抗Aβ抗體治療APP/PS1雙轉基因鼠，觀察抗體對AD轉基因鼠腦內老年斑的清除作用、腦內相關的細胞因子的變化以及動物的認知行為學變化，研究人源化抗Aβ抗體治療APP/PS1雙轉基因小鼠的免疫治療效果及免疫類型，進一步闡明抗Aβ抗體的免疫學機制，旨在為抗體進入臨床實驗奠定理論基礎。

材料與方法

一、實驗動物

36只SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠，6月齡，雌雄不拘，體質量(45±5)g。品系名稱：B6C3-TG(APPSWE,PSEN1DE9)85DBO/J，簡稱APPSWe，相關基因APP、PS1，購于廣東省動物醫學實驗中心。

二、主要試劑和儀器

人源化抗Aβ抗體由廣東省人民醫院與本實驗室共同制備并保管。HRP-羊抗小鼠IgG購自博士德公司。鼠源性抗Aβ單克隆抗體購自美國Sigma公司。MICROM HM340切片機、MICROM EC350包埋機均為德國Leica公司產品，Morris水迷宮實驗儀、Morris水迷宮測試軟件為中國科學院產品， Bio-fuge15R低溫高速離心機為德國Heraeus Instruments公司產品。

三、 治療方法

將36只APP/PS1雙轉基因小鼠分為人源化抗Aβ抗體組、鼠源性單克隆抗體10D5組(陽性對照組)和磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(陰性對照組)，每組各12只小鼠。人源化抗Aβ抗體組小鼠予腹腔注射人源化抗Aβ抗體40 μg，鼠源性單克隆抗體組予腹腔注射等劑量鼠源性單克隆抗體10D5，PBS對照組則予腹腔注射PBS，3組均為每周注射1次，每次注射體積均為100 μl，共治療3個月。

四、研究內容

注射前及每次注射后，行Morris水迷宮行為學測試各組小鼠學習記憶能力，實驗包含定位航行實驗和空間探索實驗，分別記錄平均潛伏期及跨越平臺次數，平均潛伏期越短說明小鼠的學習能力越好，跨越平臺次數越多說明小鼠的記憶力越好。

治療3個月后取小鼠尾靜脈血，處死小鼠。選取小鼠含海馬及其上方頂葉聯合皮質范圍進行免疫組織化學染色，觀察老年斑數量和分布情況。同時取小鼠腦組織勻漿，取上清液。分別檢測小鼠腦組織上清液和血清中TNF-α表達含量。

五、 統計學處理

結 果

一、Morris水迷宮行為學測試結果

1.定位航行實驗

實驗第7周起，人源化抗Aβ抗體組及鼠源性單克隆抗體組平均逃避潛伏期均比PBS對照組縮短，比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖1。

圖1 Morris水迷宮行為學測試中3組APP/PS1雙轉基因小鼠平均逃避潛伏期比較

2.空間探索實驗

與對照組相比，人源化抗Aβ抗體組與鼠源性單克隆抗體組跨越平臺次數明顯增多，比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖2。

圖2 Morris水迷宮行為學測試中3組APP/PS1雙轉基因小鼠跨越平臺次數比較

二、腦內Aβ沉積免疫組織化學染色結果

與PBS對照組比較，鼠源性單克隆抗體組與人源化抗Aβ抗體組大腦皮質、海馬區棕色斑塊沉積明顯形態變小、數量變少、范圍分散，見圖3。

圖3 3組APP/PS1雙轉基因小鼠腦內Aβ沉積免疫組織化學染色結果

三、血清和腦組織TNF-α檢測結果

人源化抗Aβ抗體組與鼠源性單克隆抗體組腦內TNF-α含量均較PBS對照組明顯減少(P<0.05)，見表1。

討 論

隨著我國逐漸進入老齡化社會，老齡相關性疾病增多，而腦老化導致的認知功能下降及癡呆是影響老年人生活質量的重要因素[1]。傳統藥物治療AD具有不良反應大，難以個體化治療的缺點。被動免疫治療AD 不需要激發T細胞以產生足夠量的抗體，避免了T細胞過度激活導致的炎癥反應。 即使發生不良反應，被動免疫治療可及時終止，避免了機體對抗體的持續暴露。與傳統治療相比，被動免疫治療便于根據不同的患者調整抗體的劑量，治療易于個體化。2000年Bard報道，鼠源性單克隆抗體治療AD可以達到和主動免疫相似療效的結果。

Rothwell 等(1995年)報道，TNF-α對神經元的營養和毒性作用與其在腦內的濃度、位置及持續時間相關，這與IL-1β對神經元的雙重作用相似，TNF-α可以直接產生神經毒性，也可釋放其他炎癥因子間接損傷神經元。本研究發現，治療后APP/PS1雙轉基因小鼠血液及腦內TNF-α含量均明顯減少。同時，炎癥反應隨淀粉樣斑塊的消退而減少，提示炎癥反應和淀粉樣斑塊形成可能密切相關，此結果與Wirths等[2]報道相似，進一步證明“腦內炎癥反應隨淀粉樣斑塊形成而產生”的研究結論。

正常人及AD患者血清中均含抗Aβ抗體。與AD患者相比，正常人血清中的抗體滴度更高，是抗Aβ抗體的“天然多克隆抗體庫”。研究發現，血清中抗Aβ抗體可能具有清除老年斑或抑制老年斑形成的作用, 具有與主動免疫誘導出的抗體相似的體外作用,顯示出潛在的AD治療價值[3-4]。進一步研究發現，靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)中含有高滴度的抗Aβ抗體，而且用有學者使用含抗Aβ抗體的IVIG治療8例AD患者取得良好療效，患者的認知功能得以改善，且其記憶下降速度明顯減緩[5]。流行病學調查也發現含有抗Aβ抗體的IVIG可以預防AD的發生[6]。一直以來，被動免疫的缺點在于生產單克隆抗體花費巨大，且需要反復注射，針對抗體的免疫反應不確定，而人源化抗Aβ抗體似乎是合理的揚長避短，達到治療AD的目的可行性方法之一。本研究發現，人源化抗Aβ抗體與鼠源性抗體在治療AD療效相近，而在抗體的獲取、提純更具優勢。雖然目前針對人源化抗Aβ抗體應用于AD的治療還有具體結合位點、作用機制和通路、最佳效價沒有完全清晰以及遠期有無并發癥等問題，尚需要進一步去討論和解決，但總體上看，人源化抗Aβ抗體在免疫治療AD方面有著得天獨厚的優勢，避免了合成Aβ單克隆抗體所需要的高昂成本，避開了主動免疫的不良反應，在體外試驗有效的基礎上，如AD轉基因鼠的在體研究能取得成功，將為抗Aβ抗體進入臨床實驗奠定可靠的基礎。

表1 3組APP/PS1雙轉基因小鼠血清及腦組織TNF-α含量比較

[1] 馬芹穎，王彥永，馬曉偉，等.快速老化小鼠SAMP8的增齡性老化特征研究. 新醫學，2013，44：415-419.

[2] Wirths O，Breyhan H，Marcello A，et al. Inflammatory changes are tightly associated with neurodegeneration in the brain and spinal cord of the APP/PS1 KI mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging，2010,31:747-757.

[3] Sohn JH, So JO, Hong HJ, et al. Identification of autoantibody against beta-amyloid peptide in the serum of elderly. Front Biosci(Landmark Ed), 2009,14: 3879-3883.

[4] Kellner A, Matschke J, Bernreuther C, et al. Autoantibodies against beta-amyloid are common in Alzheimer's disease and help control plaque burden. Ann Neurol, 2009,65: 24-31.

[5] Relkin NR, Szabo P, Adamiak B, et al.18-Month study of intravenous immunoglobulin for treatment of mild Alzheimer disease. Neurobiol Aging, 2009, 30: 1728-1736.

[6] Fillit H, Hess G, Hill J, et al. IV immunoglobulin is associated with a reduced risk of Alzheimer disease and related disorders. Neurology, 2009,73:180-185.