骨髓增生異常綜合征患者血紅素加氧酶表達水平及其臨床意義

解杰 李麗珍 黃濤 王魯群 李顥 李湘新 王玲玲 李芳鄰

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，其預后呈現明顯異質性。根據1997年Greenberg提出的國際預后評分系統(IPSS)可將MDS分為低危組、中危-1組、中危-2組和高危組。低危組患者多表現為難治性貧血、白細胞和血小板減少，但原始病態造血的程度較輕，因而多數患者生存時間較長。近來研究證實，低危MDS患者骨髓微環境中一些應激性刺激可引起造血干/祖細胞過度凋亡從而導致骨髓無效造血和外周血細胞數減少[1]。細胞的高凋亡貫穿于疾病的各個階段，以難治性貧血(MDS-RA)及環形鐵粒幼細胞性難治性貧血(MDS-RAS)為著。目前，低危MDS的治療主要是對癥支持、低甲基化治療等，但療效不理想。血紅素加氧酶-1(HO-1)參與清除細胞內氧自由基，減少細胞應激性凋亡，這種作用可能與MAPK 信號通路有關[2-3]。本研究通過檢測在不同濃度HO-1誘導劑Hemin干預下，低危MDS患者HO-1的表達水平的變化及HO-1基礎水平的變化與患者預后的關系，探討HO-1可能的作用機制和臨床靶向治療的可能。

對象與方法

一、研究對象

采集2008年9月至2012年9月在山東大學齊魯醫院血液科就診的60例初治低危MDS患者骨髓，其中男28例、女32例，年齡19～80歲、中位年齡55歲，病程0.5～8.3年、中位病程5.6年。病理分型包括：MDS-RA 45例、MDS-RAS 15例，MDS的診斷符合2008年WHO分型標準[4]。另外，采集同期在我院就診的缺鐵性貧血(IDA)患者20例的骨髓作為對照，男9例、女11例，年齡20～78歲、中位年齡50歲。所有標本取材均獲得山東大學齊魯醫院倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

二、方 法

用蛋白免疫印跡法檢測60例初診低危MDS患者骨髓單個核細胞(BMMNCs)中HO-1蛋白表達水平及JNK信號分子磷酸化水平的表達，并追蹤隨訪MDS患者無進展生存期(PFS)。

1.主要材料

胎牛血清和RPMI 1640培養液(Gibco公司)，Hemin(Sigma公司)，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和磷酸化JNK(p-JNK)、β-actin等一抗及二抗(Cell signaling technology公司)，HO-1一抗(Abcam公司)。

2.BMMNCs的提取與體外孵育

無菌條件下抽取患者骨髓5 mL，予乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，稀釋后加入Ficoll淋巴細胞分離液分離BMMNCs。將患者BMMNCs接種于含20%的胎牛血清的RPMI1640培養液中，分為4組，每組接種細胞濃度為2×106/ml。第2～4組加入不同劑量HO-1誘導劑Hemin，使Hemin在體系中的終濃度分別為5、10、20 μM，第1組培養體系中加入等量無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。于37℃、含5% 二氧化碳飽和濕度下培養48 h后收集細胞備用。

3.采用蛋白免疫印跡法檢測BMMNCs中HO-1蛋白和磷酸化JNK信號分子的表達

用RIPA細胞裂解液處理BMMNCs，提取總蛋白質，測定蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白上樣，10%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離后轉至PVDF膜上,用封閉液(含50 g/L脫脂牛奶的TBST緩沖液)室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜。第2日于室溫下洗膜后加入相應辣根過氧化物酶(HRP)耦聯羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜后用電化學發光法顯影。以β-actin條帶作為內對照。目的蛋白顯色條帶灰度與內參顯色條帶灰度比值代表目的蛋白相對表水平。

4.病例隨訪

隨訪截止日期為2013年10月。對可追蹤的60例患者進行PFS分析。PFS是從疾病確診日開始至死亡或疾病進展為止。低危MDS患者疾病進展定義為粒細胞或血小板數較最佳緩解/療效時下降≥50%或血紅蛋白下降≥20 g/L或原始細胞<5%者的原始細胞數增加≥50%達到5%。將隨訪終止時仍未發生疾病進展和死亡的患者以及失訪患者的生存期作為刪失值處理。

三、統計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理數據，單因素方差分析中用LSD-t檢驗進行組間蛋白表達量比較。進行Kaplan-Meier生存分析，并用Log-rank檢驗比較生存曲線。用COX風險比例模型分析HO-1對無進展生存期的影響。P<0.05為比較差異有統計學意義。

結 果

一、低危MDS患者BMMNCs中HO-1蛋白的表達水平

60例低危MDS患者HO-1蛋白相對表達水平為0.450±0.248，與IDA患者水平0.4913±0.2377比較差異無統計學意義(P>0.05)。用不同濃度(0、5、10、20 μM)的HO-1誘導劑Hemin體外孵育BMMNCs 48 h，HO-1蛋白相對表達水平分別為0.450±0.248、0.695±0.213、0.896±0.202、1.126±0.167，多組間比較差異有統計學意義(F值為18.938，P<0.01)，各組間兩兩比較差異均具有統計學意義(LSD-t檢驗的P值均<0.05)，提示隨著Hemin濃度的增加HO-1蛋白表達水平呈濃度依賴性逐漸升高，見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測低危MDS患者骨髓單個核細胞中HO-1蛋白的表達

二、 HO-1對磷酸化JNK信號分子表達水平的調控

不同濃度Hemin孵育BMMNCs 48 h，隨著HO-1蛋白表達量的逐漸增高，磷酸化JNK信號分子相對表達水平在各組分別為0.412±0.217、0.632±0.245、0.861±0.221、1.112±0.233，多組間比較差異有統計學意義(F值為17.163，P<0.01)，各組間兩兩比較差異均具有統計學意義(LSD-t檢驗的P均<0.05)。提示隨著HO-1表達水平的升高，磷酸化JNK信號分子表達水平也逐漸升高，見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測低危MDS患者骨髓單個核細胞中磷酸化JNK信號分子的表達

三、HO-1表達水平與低危MDS患者預后的關系

1.HO-1表達水平的高低對低危組患者PFS的影響

以低危MDS患者HO-1蛋白表達水平的均數0.450為界，將MDS患者分為兩組，超過0.450為高表達組，共30例(50%),小于0.450為低表達組，共30例(50%)。至隨訪截止日，60例患者中25例發生血液學疾病進展(41.7%)，7例進展為MDS-RA伴原始細胞增多4例或白血病3例(11.7%)。18例(30.0%)疾病好轉且穩定，至隨訪結束日未發生進展；8例(13.3%)死亡(死亡原因為感染5例、嚴重出血2例、高齡1例)；2例(3.33%)失訪。總的PFS為32.8(6.4～57.6)個月，其中HO-1高表達組患者PFS為41.6(6.4～57.6)個月，低表達組為32.0(7.4～49.3)個月，兩組比較差異有統計學意義(P=0.047)。兩組無病生存率的比較見圖3。

2.COX回歸模型分析

將HO-1蛋白表達水平納入COX回歸模型中，結果顯示HO-1表達水平是判斷低危MDS患者預后的獨立影響因素(HR為0.048，95%CI為0.005～0.420，P=0.006，回歸系數為-3.043)。以上結果提示HO-1蛋白表達量的增加將減小低危MDS患者病情進展的可能性。

討 論

MDS造血細胞的高凋亡狀態貫穿于MDS從低危到高危的各個亞型。Raza于1997年提出低危MDS患者可出現多種凋亡信號轉導的改變，其中包括MAPK通路中的p38 傳導通路及抗凋亡傳導通路ERK、JNK等的異常調節，它們多造成DNA合成期階段的造血細胞凋亡，在高危亞型患者同樣存在凋亡過度的現象，但因其骨髓中出現代償性的惡性細胞增殖而掩蓋了此現象。骨髓細胞凋亡的調控如何影響低危MDS患者的預后，不同研究者均有相似見解。其中，骨髓造血細胞保護機制，如血紅素加氧酶/一氧化碳(HO-CO)系統、熱休克蛋白系統和集落刺激因子系統信號的調節可明顯抑制細胞凋亡。Navas等于2006年報道體外抑制低危MDS骨髓細胞凋亡，發現其造血祖細胞集落形成能力顯著增強，說明抑制細胞凋亡可明顯改善MDS患者骨髓造血。同年，Kim等通過體內試驗將抗凋亡制劑(己酮可可堿、環丙沙星、地塞米松等)用于低危MDS患者，發現隨著骨髓造血細胞凋亡率的減低其外周血三系細胞數明顯提升，提示抑制造血細胞高凋亡可能是改善低危組MDS患者預后的一條新途徑。

HO-1 廣泛存在于機體的各個組織、器官，參與機體的氧化還原、組織修復及DNA修復等多種與細胞保護有關的反應，可通過抗氧化、抗應激、抗凋亡等發揮細胞保護作用[5-6]。有學者在小鼠移植模型中發現，HO-1單倍體基因突變導致其表達不足時，會使應激狀態下小鼠骨髓和脾臟各階段紅系造血細胞數目減少、鐵代謝再循環利用受阻、巨噬細胞分泌TNF-α等造血負調控因子增多，說明應激狀態下紅系祖細胞保持正常的增殖、代謝及分化成熟過程中HO-1起到關鍵的調節作用[7]。Morita等于2009年報道，他們的研究證明HO-CO信號系統的上調可以抑制p38MAPK途徑信號激活，調節骨髓基質中干細胞因子(SCF)、血管內皮生長因子(VEGF)的產生，從而調控造血細胞的增殖。本研究通過隨訪低危MDS患者的狀況，觀察到HO-1高表達組患者PFS長于HO-1低表達組患者。通過COX回歸分析觀察到HO-1的表達水平是判斷低危組MDS預后的獨立因素，提示HO-1是阻止病情進展的保護性因素。上調HO-1的表達可能會通過優化造血細胞的增殖條件而減輕造血細胞的凋亡，從而改善MDS低危患者的預后狀況。

基礎實驗證明HO-1可以調控MAPK信號通路中的JNK發揮細胞保護作用。Das等于2006年報道在大鼠心肌缺血再灌注模型中，HO-1通過環鳥苷酸依賴的蛋白激酶G(PKG)可激活JNK從而抑制心肌細胞壞死和凋亡，而應用JNK抑制劑可以阻斷HO-1對心肌細胞的保護作用，這說明HO-1可上調磷酸化JNK信號分子水平的表達。為了進一步探討HO-1對低危MDS患者預后的影響，我們給予不同濃度Hemin進行體外干預，發現隨著HO-1蛋白分子表達量的逐漸增加，磷酸化JNK信號分子表達水平也逐漸升高，提示HO-1可能通過調控JNK信號分子活性來調節造血細胞增殖與凋亡的過程。

Nagata于1998年提出JNK主要通過調節鐵代謝而影響血紅蛋白的合成。在骨髓細胞中JNK被激活后可進一步增強應激性轉錄因子c-Jun活性，后者可與鐵蛋白H基因的ARE區結合，增加鐵蛋白表達，維護細胞內鐵平衡，促進血紅蛋白的穩定而有效合成并誘導紅系造血祖細胞的分化。JNK還能通過促進紅系爆式集落形成單位(BFU-E)細胞增殖，使細胞周期由G0期過渡到G1期，該過程可能與JNK激活下游轉錄因子AP-1，誘導Cyclin D1基因的表達有關。Malcovati等[8]在臨床研究中發現低危MDS患者血紅蛋白水平與預后密切相關，中重度貧血患者中位生存期明顯低于輕度貧血患者，通過COX回歸分析證明血紅蛋白水平的降低是影響患者預后的危險因素。HO-1表達水平上調可激活JNK信號分子活性，從而進一步促進紅系造血而有助于改善低危MDS的不良預后。此外，JNK不僅促進紅系造血，在骨髓粒系造血細胞中，還可通過磷酸化激活CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)轉錄因子的活性，后者可能通過上調重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)受體表達促進粒系祖細胞分化成熟。

HO-1作為一種保護性因子，其對低危MDS患者PFS的延長作用可能與激活JNK信號分子活動而改善MDS無效造血有關。Hemin是HO-1誘導劑，在低危MDS中，Hemin可有效上調HO-1的表達，具有濃度梯度依賴性，Hemin能否作為新的MDS靶向治療藥物有待于進一步探討。綜上所述，HO-1為改善低危組MDS患者預后以及延長患者生存期提供了一個新的研究方向，而且為呈高度異質性的MDS患者個體化治療提供了有力依據。

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