哮喘患兒外周血RORC mRNA、IL-17水平及其與氣道重塑的關系研究

黃雪瓊 檀衛平 王東燁 麥賢弟 吳葆菁 李靜 藍丹

支氣管哮喘是常見的氣道慢性疾病，除持續性氣道炎癥外，氣道重塑是哮喘的另一重要特征。氣道重塑病理基礎包括氣道上皮細胞和平滑肌增生、黏液高度分泌、上皮下組織纖維化，以及血管生成[1]。目前評估氣道炎癥的指標包括，痰液中嗜酸性粒細胞(EOS)，呼出氣一氧化氮等，而氣道重塑的評估需要行有創性氣道黏膜活組織檢查(活檢)，臨床難以實現。鑒于近年研究發現Th17細胞及其介導的中性粒細胞炎癥在哮喘氣道重塑過程中起著重要作用[2]。本研究擬通過檢測哮喘兒童外周血單個核細胞(PBMC)中Th17細胞的轉錄因子維甲酸相關孤兒核受體C(RORC) mRNA和主要效應因子IL-17表達水平，以及通過高分辨CT(HRCT)觀察患兒氣道重塑的影像學改變，探討其相互聯系，為哮喘氣道重塑評估尋求新指標，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2010年9月至2012年8月在中山大學孫逸仙紀念醫院兒科哮喘專科門診及住院就診的中重度持續哮喘兒童45例。其中處于哮喘急性發作期25例，男16例，女9例，年齡(7.9±2.3)歲；臨床緩解期(經過治療或未經治療癥狀、體征消失，肺功能恢復到急性發作前水平，并維持3個月以上)20例，男12例，女8例，年齡(8.2±2.5)歲。兒童哮喘診斷、分期、分度標準均按2008年中華醫學會兒科學分會呼吸學組修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中兒童支氣管哮喘診斷標準[3]。健康對照組：選擇20名進行健康體檢的兒童，均為無過敏性疾病和近期無呼吸道感染的健康兒童，男10名，女10名，年齡(8.0±1.6)歲。CT對照組：選擇中山大學孫逸仙紀念醫院小兒外科收治的10例肝母細胞瘤、原發性腹膜良性腫瘤患兒，年齡(7.2±2.5)歲，均無呼吸道病變。所有受試者無惡性腫瘤病史及自身免疫病史，近4 周內未使用全身腎上腺皮質激素(激素)等免疫抑制藥。

二、主要試劑及儀器

主要試劑包括：人IL-17 ELISA試劑盒，購自武漢中美公司；ABI MultiScribeTMReverse Transcriptase逆轉錄試劑盒及SYBR Green 熒光染料試劑均購自美國ABI公司。HRCT使用SIEMENS SOMATOM Sensation 64 CT系統。

三、方 法

1.PBMC的分離和培養

抽取入選研究對象的外周靜脈血2 ml，使用依地酸二鈉抗凝。常規Ficoll密度梯度離心法分離PBMC， 加入RPMI 1640培養液重懸PBMC，調整細胞密度為2×106/ml。每孔0.5 ml接種于24孔板，加入anti-CD3(OKT3)(0.2 mg/L)、 antiCD28(1 mg /L)，置于37℃、5 %CO2飽和濕度培養箱培養72 h，收集PBMC，置于-80℃冰箱凍存備用。

2.PBMC的IL-17水平檢測

收集上述培養PBMC，采用雙抗體夾心ELISA法測定細胞IL-17的水平。具體操作嚴格按照試劑盒說明書操作，每個樣本和標準品均設2個復孔，酶標儀492 nm處測定各孔吸光值。

3.PBMC的RNA提取及實時定量PCR檢測

收集上述培養PBMC，采用Trizol試劑盒分離出總RNA，核酸測定儀測RNA純度(A260/A280)，純度要求為1.8～2.0。按照ABI MultiScribeTMReverse Transcriptase試劑盒說明書進行半量體系RNA逆轉錄模板DNA。采用SYBE GREEN實時熒光定量PCR檢測RORC mRNA的表達水平，內參基因NAPDH，半定量反應體系(12.5 μl)，參照說明書設定PCR程序，95℃ 10 min變性，然后95℃ 15 s，60℃ 30 s，重復40個循環進行擴增。反應結束，設定最佳閾值，獲取CT值，根據儀器給出的標準曲線和斜率，獲得目的基因的相對表達指數。引物由上海生物工程有限公司根據設計合成，序列見表1。

4.小支氣管氣道面積和管壁厚度變化的測量

選取其中14例病程較長[病程3～8(中位數4.5)年]的臨床緩解期患兒，采用HRCT進行胸部檢測及支氣管壁測量。HRCT條件：層厚3 mm，取吸氣末3個橫斷層面(主動脈弓上、氣管分叉、下肺靜脈)進行測量；橫斷圖像上每個層面選取雙側管腔內徑0.5～2 mm的氣道各3支，取平均值作為每次的測量值。測量指標：氣道內徑(L)、氣道外徑(D)、氣道腔面積(Ai)、氣道總面積(Ao)。選用氣道壁厚度與氣道管腔外徑之比值(T/D)、氣道壁面積占氣道總截面積的百分比(WA%)及氣道腔面積(Ai)作為觀察指標，見圖1。

表1 引物序列

圖1 小支氣管氣道面積和管壁厚度測量示意圖

四、統計學處理

結 果

一、中重度哮喘患兒與正常對照組PBMC中RORC mRNA、IL-17表達水平比較

哮喘急性發作期患兒RORC mRNA、IL-17表達水平明顯高于緩解期和正常對照組患兒(P<0.05)，與正常對照組相比，緩解期患兒IL-17水平明顯增高(P<0.05)，而兩組RORC mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

二、中重度哮喘緩解期患兒與正常對照組兒童支氣管測量T/D、WA%、Ai比較

與正常對照組兒童相比，哮喘緩解組患兒T/D、WA%均明顯增加，而Ai較正常對照組兒童狹窄(P均<0.05)，見表3。

三、中重度哮喘緩解期患兒T/D、WA%與IL-17相關性分析

中重度哮喘緩解期患兒T/D、WA%均與其PBMC IL-17水平呈正相關，r分別為0.78、0.77(P均<0.05)，見圖2。

表2 哮喘急性發作期、緩解期患兒和正常對照組兒童RORC mRNA、IL-17表達水平比較

表3 哮喘兒童T/D、WA%及Ai與正常兒童的比較

討 論

哮喘是一種免疫紊亂的變態反應性疾病，主要表現為慢性氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑[4]。近年來Th17細胞作為 CD4+T細胞調節中性粒細胞參與哮喘氣道炎癥、氣道重建的中介作用備受關注[5]。我們的前期研究顯示IL-17與中重度兒童哮喘氣道中性粒細胞炎癥密切相關[6]。動物實驗顯示IL-17通過誘導IL-6、IL-8、PGE2及G-CSF等炎癥因子的產生，活化、動員中性粒細胞并募集到氣道，放大炎癥反應；中性粒細胞活化后可釋放彈性蛋白酶、髓過氧化物酶及蛋白水解酶等介質，參與氣道損傷和修復過程[7]。此外，IL-17還可刺激轉化生長因子-β、IL-11等多種促炎因子及黏蛋白基因表達，參與氣道上皮損傷、黏液高度分泌、氣道上皮下纖維化和血管生成等氣道重塑過程[8]。但兒童哮喘氣道重塑與IL-17之間的關系尚不清楚。

RORC和IL-17分別為Th17細胞的上游調控基因和主要效應因子。RORC基因參與哮喘發病過程是由其下游的細胞Th17細胞與IL-17介導的。研究顯示，哮喘患者的肺組織RORC mRNA表達水平明顯上調，同時外周血、支氣管灌洗液及痰液中IL-17表達均顯著增高，且與氣道高反應性程度呈正相關[9-10]。本研究發現，哮喘患兒急性發作期外周血PBMC中RORC mRNA表達和IL-17水平明顯高于緩解期和正常對照組，緩解期患兒RORC mRNA表達降至正常，而IL-17水平仍明顯高于正常對照組，表明在哮喘的急性發作中轉錄因子RORC通過促進細胞因子IL-17的基因轉錄，加重氣道炎癥及氣道高反應性[11]。IL-17水平在緩解期仍持續升高，則可能是通過減少翻譯后的蛋白降解途徑，參與哮喘的慢性過程。本研究通過HRCT檢查評估兒童哮喘的氣道重塑，發現與正常對照組比較，中重度哮喘患兒緩解期氣道管徑明顯狹窄，而氣道壁厚度和面積較正常對照組明顯增加，且與同期外周血IL-17表達水平呈正相關，表明IL-17不僅在哮喘急性發作期參與氣道炎癥和氣道高反應性，且在緩解期促進氣道重塑的發生發展。

圖2 中重度哮喘緩解期患兒PBMC IL-17水平與同期氣道壁厚度(A)及面積(B)呈正相關

近年來兒童哮喘的治療目標不僅要有效控制氣道慢性炎癥，更力求減少氣道重塑的發生，進而減少兒童哮喘向成人哮喘發展。目前指南推薦的吸入性激素(ICS)治療雖能有效控制嗜酸性粒細胞介導的氣道炎癥，但對中性粒細胞炎癥及氣道重塑無效。IL-17作為促進哮喘中性粒細胞炎癥的重要因子，與哮喘氣道重塑關系密切，有望成為防治哮喘的新靶點。

[1] Gras D, Bourdin A, Chanez P, et al. Airway remodeling in asthma: clinical and functional correlates. Med Sci (Paris),2011,27:959-965.

[2] Al-Ramli W, Préfontaine D, Chouiali F, et al. T(H)17-associated cytokines (IL-17A and IL-17F) in severe asthma. J Allergy Clin Immunol, 2009, 123:1185-1187.

[3] 中華醫學會兒科學分會呼吸學組. 兒童支氣管哮喘診斷與防治指南. 中華兒科雜志，2008，46：745-753.

[4] 檀衛平, 夏焱, 吳葆菁, 等. T-bet基因轉染對哮喘小鼠氣道炎癥的影響. 中國病理生理雜志, 2009,25：2399-2402.

[5] Doe C, Bafadhel M, Siddiqui S, et al. Expression of the T helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD. Chest,2010,138:1140-1147.

[6] 李靜，檀衛平，吳葆菁，等. 中重度哮喘患兒白細胞介素-17與中性粒細胞炎癥反應的關系. 中山大學學報：醫學科學版, 2010，31：449-456.

[7] Jones CE, Chan K. Interleukin-17 stimulates the expression of interleukin-8, g rowth-related oncogene-alpha, and granulocyte-colony-stimulating factor by human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol,2002,26:748-753.

[8] Fujisawa T, Velichko S, Thai P, et al. Regulation of airway MUC5AC expression by IL-1beta and IL-17A; the NF-kappaB paradigm. J Immunol,2009,183:6236-6243.

[9] Bullens DM, Truyen E, Coteur L, et al. IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients:linking T cell driven inflammation and granulocytic influx? Respir Res,2006,7:135.

[10] Wilson RH, Whitehead GS, Nakano H, et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med,2009,180:720-730.

[11] Durrant DM, Gaffen SL, Riesenfeld EP, et al. Development of allergen-induced airway inflammation in the absence of T-bet regulation is dependent on IL-17. J Immunol, 2009, 183:5293-5300.