pcDNA-DEST47-miR-29b重組質粒的構建及其對VEGF表達的靶向調控作用

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(1.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，長春 130021；2.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133000)

·現代醫學研究·

pcDNA-DEST47-miR-29b重組質粒的構建及其對VEGF表達的靶向調控作用

單鴻閣1,2，高輝1，張海芹1，董娟聰1，金順子1*

(1.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，長春 130021；2.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133000)

目的 構建has-miR-29b重組表達載體,并探討其對VEGF表達的靶向調控作用。方法 利用生物信息學方法預測has-miR-29b與VEGF-3′UTR的結合位點;將PCR擴增的miR-29b前體序列和pcDNA-DEST47載體經酶切后連接，構建pcDNA-DEST47-miR-29b表達載體；采用熒光素酶檢測法和Western blot法證實miR-29b對VEGF蛋白表達的抑制作用。結果 psiCHECK2-VEGF熒光素酶報告質粒和pcDNA-DEST47-miR-29b兩種質粒共轉染組的熒光素酶活性明顯低于單獨轉染的空載體組和Lu-VEGF組(P<0.01),同時發現其他種類miRNA(Let-7g)不能抑制VEGF熒光素酶活性，而miR-29b明顯抑制VEGF熒光素酶活性;轉染pcDNA-DEST47-miR-29b質粒后在Jurkat細胞中VEGF蛋白的表達明顯受抑制。結論 本研究成功構建pcDNA-DEST47-miR-29b重組質粒；miR-29b與VEGF具有靶向關系,且miR-29b參與其調控作用。

miR-29b；VEGF；腫瘤；調控

miRNA是一種具有21～25核苷酸長度的單鏈小分子RNA，屬于非編碼RNA，成熟的miRNA 5′端的磷酸基團和3′端的羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區分標志。miRNA存在于多種生物基因組內，主要在轉錄后水平發揮調控作用，抑制約40%～50%的蛋白質編碼基因，從而構成了一個龐大的轉錄后調控網絡，發揮其重要作用[1-2]。現已證明[3]，miRNA與機體的胚胎發育、細胞增殖和凋亡以及腫瘤發生密切相關，特別是在腫瘤發生、發展過程中可起到癌基因或抑癌基因作用。miR-29b是一種非常重要的miRNA,其在生物體中扮演著抑癌基因的角色，對避免生物體細胞的癌變起到非常重要的作用。在多種腫瘤細胞中，miR-29b通過對不同靶基因表達的調控作用，解除對一系列導致靶基因的表達失調，從而調節細胞的正常生物學功能[4-5]。本實驗首先利用生物信息學方法預測has-miR-29b與VEGF-3′UTR的結合位點,擬構建miR-29b的重組質粒和VEGF-3′UTR的熒光素酶報告質粒，并證實miR-29b與VEGF具有靶向關系，并且具有調控作用，為進一步探討miR-29b在腫瘤細胞中的作用機制及功能提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與轉染 Jurkat細胞由本實驗室保存,RPMI-1640培養液中加入含10%胎牛血清，置37 ℃，5%CO2的培養箱中培養。用500 μL滅菌水稀釋4 μg重組質粒并加入10 μL脂質體，室溫放置20 min制成DNA-脂質體溶液。將DNA-脂質體溶液加入已換成無血清培養基的Jurkat細胞中，繼續培養6 h后更換完全培養基。

1.2 重組真核表達載體的構建和鑒定 1)生物信息學預測miR-29b與VEGF-3′UTR結合位點采用常見的靶標基因預測軟件Targetscan及RNAhybrid預測miR-29b與VEGF的3′UTR結合位點。在線預測網站分別為http://www.microrna.org和http://microrna.sanger.ac.uk。

Has?mIR?29bUUGUGACUAAAGUUUACCACGAU |·||：|·||||··|·||||||||VEGF?3′UTRATCATTTATTT--ATTGGTGCTA

2)psiCHECK2-VEGF-3′UTR熒光素酶報告質粒(以下簡稱為Lu-VEGF)的構建:用psiCHECK-2載體(美國，Promega公司)設計VEGF-3′UTR片段序列，通過PCR從基因組DNA釣出VEGF-3′UTR，連到T-easy載體(美國，Promega公司)，測序確認，最后用NotⅠ酶切，插入psiCHECK-2載體中，測序后確認克隆成功。VEGF-3′UTR引物序列如下：上游5′-TCTACCTCCACCATGCCAAGT-3′;下游3′-TTCCTCCTCCCGTCTTAGTAG-5′。3)pcDNADEST47-miR-29b質粒(以下簡稱為miR-29b)的構建:以VEGF為模板，設計miR-29b引物序列。將PCR片段插入到pCR8/GW/TOPO TA載體(美國，Invitrogen公司)后測序，再將其片段克隆到pcDNA DEST47載體(美國，Invitrogen公司)中，測序后確認克隆成功。hsa-miR-29b引物序列如下：上游5′-TGTGCCCTTGCCTCTAAATG-3′；下游3′-GGGAGTTCC-TATGGTTCCCT-5′。

1.3 熒光素酶檢測 采用Lipofectamine-2000將miR-29b質粒和Lu-VEGF質粒共轉染至Jurkat細胞中，48 h后收集細胞，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System(美國，Promega公司)試劑盒，用Lumino meterinstrument(infinite M200，TECAN)儀器測定其熒光素酶表達量。

1.4 Western blot法 將提取的總蛋白加熱變性，經10%SDS-PAGE后轉移至PVDF膜上，用含5%BSA的TBST緩沖液封閉1 h，加入抗VEGF單克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃過夜；用含吐溫-20的TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入HRP標記的兔抗鼠IgG(1∶1 000稀釋),室溫孵育1 h；用含吐溫-20的TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，ECL化學發光法檢測條帶。以β-肌動蛋白作為內參，采用Super Signal West Dura(美國，Thermo公司)試劑盒，用LAS mini4000 chemiluminoscent signal detectioninstrument(日本,Fujifilm公司) 儀器曝光，然后用Multi Gauge V 3.1軟件分析數據，操作重復3次。

2 結果

2.1 成功構建重組質粒pcDNA DEST47-miR-29b和Lu-VEGF熒光素酶報告質粒 將擴增的miR-29b PCR片段插入到pCR8/GW/TOPO TA載體后測序，再將其片段克隆到pcDNA DEST47載體中，測序后確認克隆成功。目的片段has-miR-29b的大小為786 bp(圖1B)，與測序結果相符(圖1C)。設計VEGF-3′UTR片段序列,通過PCR從基因組DNA釣出VEGF-3′UTR，連到T-easy載體，測序確認后用NotⅠ酶切，插入psiCHECK-2載體中，測序后確認克隆成功。目的片段VEGF-3′UTR的大小為201 bp(圖1A)，與測序結果相符(圖1D)。

2.2 miR-29b對VEGF-3′UTR的靶向調控作用 采用熒光素酶檢測法和Western blot法證實miR-29b對VEGF-3′UTR靶向調控。從圖2A看出，miR-29b和Lu-VEGF質粒共轉染組的熒光素酶活性明顯低于單獨轉染的空載體組和Lu-VEGF質粒組(P<0.01)；同時將Let-7g作為對照組檢測熒光素酶活性，結果發現miR-29b明顯抑制VEGF熒光素酶活性,而Let-7g不能抑制VEGF。從圖2B和C可看出，轉染pcDNA-DEST-mir-29b質粒后，可以誘導其靶分子VEGF蛋白表達的抑制，約降低至42%(重復3次，結果基本一致)。

3 討論

近年來，有大量文獻[6-7]報道關于miRNA作為腫瘤治療靶點的可能性。可以說， 通過調控miRNA進行體內腫瘤治療的手段是目前miRNA在腫瘤中作用的最大熱點之一，并取得了一些理論上及技術體系上的新突破[8]。目前應用miRNA體內治療腫瘤方面的成功范例還僅僅局限于小鼠某些的特定腫瘤模型，因此，還有大量的未知領域值得進一步探討。為進一步探索miR-29b的生物學功能，本實驗人工合成miR-29b重組質粒和VEGF-3′UTR的熒光素酶報告質粒，探討has-miR-29b對VEGF的靶向調控作用。

A為miR-29b對VEGF熒光素酶活性的影響,B為miR-29b靶向調控VEGF蛋白的電泳圖，C為電泳帶的灰度值分析圖(n=3,#P<0.01)。

在本實驗中，首先兩種質粒共轉染組的熒光素酶表達明顯低于單獨轉染的空載體和Lu-VEGF組(P<0.01)，另外用其他miRNA(Let-7g)做對比觀察發現，miR-29b與VEGF-3′UTR特異結合，而其他miRNA不能結合，說明miR-29b與VEGF可能是靶向關系。其次，采用Western blot方法，觀察轉染pcDNA-DEST-miR-29b質粒后，Jurkat細胞表達VEGF蛋白的情況，發現miR-29b與VEGF-3′UTR結合，降低蛋白的表達，可以認為miR-29b對VEGF有靶向調控作用。VEGF因其促凋亡活性和引起免疫反應的能力可阻止腫瘤的發生，但隨著腫瘤的形成和免疫防御的喪失，VEGF又能促進與腫瘤浸潤和轉移有關基因的表達，使患者的預后惡化[9]。研究[10]發現，miR-29b能夠抑制胃癌細胞遷移和增殖，可見VEGF及其靶向關系的miR-29b有可能成為診斷及治療腫瘤的新靶標。通過對miR-29b與VEGF以及腫瘤關系的研究，可以從非編碼RNA水平揭示腫瘤發生、發展的內在機制,并為尋找治療腫瘤有效的新靶標提供理論依據。

[1]Corbin R,Olsson-Carter K,Slack F.The role of microRNAs in synaptic development and function[J].BMB Rep,2009,42(3):131-135.

[2]Cordes K R,Srivastava D.MicroRNA regulation of cardiovascular development[J].Circ Res,2009,104(6):724-732.

[3]Chua J H,Armugam A,Jeyaseelan K.MicroRNAs:biogenesis,function and applications[J].Curr Opin Mol Ther,2009,11(2):189-199.

[4]Amodio N,Bellizzi D,Leotta M,et al.miR-29b induces SOCS-1 expression by promoter demethylation and negatively regulates migration of multiple myeloma and endothelial cells[J].Cell Cycle,2013,12(23):3650-3662.

[5]Li P,Guo W,Du L,et al.microRNA-29b contributes to pre-eclampsia through its effects on apoptosis,invasion and angiogenesis of trophoblast cells[J].Clin Sci (Lond),2013,124(1):27-40.

[6]Tavazoie S F,Alarcón C,Oskarsson T,et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature,2008,451(7175):147-152.

[7]Davis M E,Zuckerman J E,Choi CH,et al.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles[J].Nature,2010,464(7291):1067-1070.

[8]Hafner M,Landthaler M,Burger L,et al.Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP[J].Cell,2010,141(1):129-141.

[9]Forrest A R,Kanamori-Katayama M,Tomaru Y,et al.Induction of microRNAs,mir-155,mir-222,mir-424 and mir-503,promotes monocytic differentiation through combinatorial regulation[J].Leukemia,2010,24(2):460-466.

[10]Lang N,Liu M,Tang Q L,et al.Effects of microRNA-29 family members on proliferation and invasion of gastric cancer cell lines[J].Chin J Cancer,2010,29(6):603-610.

ConstructionofpcDNA-DEST47-miR-29banditsregulatoryeffectsonexpressionofVEGF

SHAN Hongge1,2,GAO Hui1,ZHANG Haiqin1,DONG Juancong1,JIN Shunzi1*

(1.Key Laboratory of Radiobiology,Ministry of Health,School of Public Health,Jilin University,Changchun,130021,China;2.Medical College of Yanbian University,Yanji 13300,Jilin province,China)

ObjectiveTo construct the recombinant expression vector of has-miR-29b and to explore its effect on expression of VEGF.MethodsBioinformatics was used to analyze the potential binding sites of has-miR-29b and VEGF-3′UTR.The precursor of miR-29b was amplified by PCR and the PCR products were cloned into digestion pcDNA-DEST47 vector to construct pcDNA- DEST47-miR-29b expression vector.The effect of miR-29b interaction with the 3’-UTR of VEGF on luciferase activity was detected with a dual 1uciferase assay system and the expression level of VEGF protein affected by miR-29b was detected by Western blotting.ResultsThe luciferase activity was significantly lower in cells co-transfected with psiCHECK2-VEGF luciferase reporter plasmid and pcDNA-DEST47-miR-29b compared with empty vector group and Lu-VEGF group (P<0.01).The luciferase activity was not inhibited in the other types of miRNA (Let-7g),whereas miR-29b could negatively regulate the luciferase activity by interacting with the 3’-UTR of VEGF.VEGF protein expression was significantly inhibited in Jurkat cells transfected with pcDNA-DEST47-miR-29b plasmid.ConclusionpcDNA- DEST47-miR-29b plasmid were successfully constructed;miR-29b targetedly regulates the expression of VEGF.

miR-29b;VEGF;tumors;regulation

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.062

國家自然科學基金項目(30870584,81371890);教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目(20120061110063)。

單鴻閣(1991-)，男，大學本科。研究方向：腫瘤表觀遺傳學。

] 金順子，電話：0431-85619443，電子信箱：jinsz@jlu.edu.cn。

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：2095-6258(2014)04-0722-04

2014-03-29)

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