RP-HPLC法測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯含量

王永生，遲 航，徐 陽，羅 陽，曲曉波*

(1.長春中醫藥大學，長春130117;2.吉林大學，長春130021)

RP-HPLC法測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯含量

王永生1，2，遲 航1，徐 陽2，羅 陽1，曲曉波1*

(1.長春中醫藥大學，長春130117;2.吉林大學，長春130021)

目的 運用RP-HPLC法測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯的含量。方法 使用Agilent zorbax-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相∶甲醇-水(79∶21);柱溫:30℃;體積流速:1.5 mL/min;檢測波長:210 nm;進樣量均為10 μL。結果 哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯進樣量在0.188 4～0.502 4 μg范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為100.61%，RSD值為1.01%，且重復性、精密度、穩定性均良好。結論 此方法可以通過RP-HPLC法快速、穩定、精密的測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯的含量，減少以往利用正相色譜的不便。

哈蟆油;RP-HPLC法;膽固醇棕櫚酸酯;含量測定

哈蟆油，又名雪蛤油，哈士蟆油等，始載于明代《本草綱目》，具有補腎益精，養陰潤肺的功效，是我國一種名貴的動物藥材，有極高的營養保健價值。哈蟆油中有一半以上為蛋白質、氨基酸類，更含有不飽和脂肪酸、激素、磷脂類、核酸類、固醇類、酰胺類、維生素、糖類和微量元素等［1-7］。哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯為哈蟆油滋陰壯陽的主要藥效成分［8-11］，本文擬利用RP-HPLC法對哈蟆油的主要有效成分膽固醇棕櫚酸酯進行含量測定，建立新的哈蟆油質量測定方法。

1 材料

儀器:安捷倫1260型液相色譜儀(美國安捷倫有限公司);AVW20D型電子天平(日本島津制作所);RE 52-99旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);KQ-400KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。試藥:膽固醇棕櫚酸酯對照品(自制，純度99%以上);甲醇為色譜純級，石油醚為分析級，水為娃哈哈純凈水。樣品:哈蟆油(Ranae oviductus)，購于2012年12月，經長春中醫藥大學姜大成教授鑒定為蛙科動物中國林蛙的輸卵管干制品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱:Agilent zorbax C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相∶甲醇-水(79∶21);柱溫:30℃;體積流速:1.5 mL/min;檢測波長為210 nm;進樣量均為10 μL。理論塔板數按膽固醇棕櫚酸酯計算均不低于2 000。在此條件下，膽固醇棕櫚酸酯與其他物質分離度均符合藥典規定。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取膽固醇棕櫚酸酯3.14 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成0.031 4 mg/mL的膽固醇棕櫚酸酯標準品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 哈蟆油粉碎，過60目篩，精密稱定1 g，加100 mL的石油醚超聲提取約20 min，過濾，在藥渣中加入100 mL石油醚超聲提取約30 min，過濾，并用100 mL石油醚洗滌藥渣，合并石油醚提取液，蒸干，用色譜甲醇溶解并用定容于10 mL容量瓶中。

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液6，8，10，12，14，16 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積(Y)對溶液濃度(X)作圖，得到膽固醇棕櫚酸酯的回歸方程為Y=5.737 1X－9.241 9，r=0.999 8(n=6)，表明膽固醇棕櫚酸酯進樣量在0.188 4～0.502 4 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μL，重復進入高效液相色譜儀6次，測得膽固醇棕櫚酸酯色譜峰面積的RSD值分別為1.85%和1.48%，結果表明此方法精密度良好。

2.6 穩定性考察 精密吸取哈蟆油樣品(批號為20121201)制備的供試品溶液 10 μL，分別在 0，2，4，6，8，10，12，24 h 時，依次進樣，測得膽固醇棕櫚酸酯色譜峰面積的RSD值為1.75%(n=8)，結果表明供試品溶液中膽固醇棕櫚酸酯在24 h內穩定。

2.7 重復性實驗 取哈蟆油樣品(批號:20121201)6分，每分約1 g，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，依法進行含量測定，測得膽固醇棕櫚酸酯色譜峰面積，并計算出其含量的RSD值為1.65%，結果表明此方法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗 取膽固醇棕櫚酸酯對照品6分，每分約15 mg，定容至10 mL容量瓶中，吸取1 mL，分別加入6分約0.5 g的哈蟆油樣品(批號:20121201)與10 mL容量瓶中。按“2.3”項下制備供試品溶液，并進行含量測定，計算回收率。結果膽固醇棕櫚酸酯的平均回收率為100.61%，RSD值為1.01%(n=6)，表明此方法回收率良好。

2.9 樣品測定 取不同產地哈蟆油樣品，按照制備供試品方法制備，分別精密吸取對照品和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀器中，依法進行含量測定，記錄色譜峰面積，并按照外標法計算供試品溶液中膽固醇棕櫚酸酯的含量，結果見表1。

表1 不同產地哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯的含量

3 小結

3.1 提取方法的考察 通過查閱文獻，選擇對比回流提取和超聲提取方法，發現回流提取樣品中膽固醇棕櫚酸酯含量較低，并雜質成分有所增加，故選用超聲波提取法進行提取。

3.2 流動相的考察 通過選擇不同比例的乙腈與水(95∶5～85∶15)、甲醇與水(95∶5～75∶25)作為流動相進行試驗，結果表明，甲醇與水(79∶21)可以將膽固醇棕櫚酸酯和雜質很好的分離，且保留時間適中，峰形良好。

3.3 檢測波長的考察 因哈蟆油中成分較為復雜，不同成分的吸收不同，故在實驗過程中以考察多種波長下的主峰與雜質的分離度進行篩選其檢測波長，至能準確的計算膽固醇棕櫚酸酯的含量。膽固醇棕櫚酸酯為低波長吸收，過低波長可能影響基線平衡，故選擇210 nm為測定波長。

:

［1］范玉林，崔香順，姚玉霞，等.哈士蟆油成分研究的進展［J］.吉林農業大學學報，1996，18(3):109-115.

［2］胡鑫，劉成柏，陳曉平，等.林蛙油中主要營養保健成分含量的研究［J］.吉林農業大學學報，2003，25(2):218-220.

［3］王麗蘭，楊鳳和，王春霖，等.哈蟆油核酸含量分析［J］.中草藥，1990，21(12):21-23.

［4］趙文英，侯振榮，孫國忱.哈蟆油的研究進展［J］.沈陽藥科大學學報，1996，13(1):68-72.

［5］王永生，姜大成，王恩思.哈蟆油脂溶性化學成分的研究［J］.中成藥，2006，28(1):93-94.

［6］林紀嫻，廖靜華，于中澤.中國林蛙與中華大蟾蜍輸卵管幾種脂溶性維生素的比較分析［J］.中藥材，1991，14(12):11-12.

［7］于洋，姜大成，張煒煜.哈蟆油對免疫力低下小鼠體內脂肪酸含量的影響［J］.長春中醫藥大學學報，2008，24(2):150-151.

［8］衛功慶，張愛武，蘇鳳燕，等.哈士蟆油與青蛙油脂肪酸及膽固醇的比較研究［J］.吉林農業大學學報，1999，21(S1):39-41.

［9］王永生，趙曉歐，白雪潔，等.哈蟆油薄層色譜指紋圖譜研究［J］.特產研究，2009(3):31-33，36.

［10］曲曉波，張煒煜.正確認識哈蟆油的價值［N］.中國中醫藥報，2012-11-02(7)，2014-05-27.

［11］王永生，姜大成，孟勤，等.HPLC測定哈蟆油中十六烷酸膽甾醇酯含量研究［J］.中國中藥雜志，2005，30(13):990-991.

Determination of cholesterol palmitate in oviductus ranae by RP-HPLC

WANG Yongsheng1，2，CHI Hang1，XU Yang2，LUO Yang1，QU Xiaobo1*
(1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Jilin University，Changchun 130021，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of Cholesterol palmitate in Oviductus Ranae by RP-HPLC.MethodsThe chromatographic column:Agilent zorbax-C18(4.6 × 150 mm，5 μm);The mobile phase:methanol-water(79:21);The column temperature:30 ℃;The volumetric flow rate:1.5 mL/min;The UV detector was set at 210 nm;The sample size:10 μL.ResultsCholesterol palmitate showed good liner relation when the content was during 0.188 4 ～0.502 4 μg in the samples，the average recovery was 100.61%，RSD=1.01%，good stability，precision and repeatability;ConclusionThis method can determine the contents of Cholesterol palmitate in Ranae Oviductus，it is fast，accurate and stable and reduce the use of normal phase chromatography inconvenience in the past.

Key words:ranae oviductus;RP-HPLC;cholesterol palmitate;content determination

R284.1

A

2095－6258(2014)04－0604－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.015

國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B07)。

王永生，博士，教授，博士研究生導師。研究方向:中藥有效成分研究。

曲曉波，女，博士，教授，博士研究生導師，電話:0431-86172508，電子信箱:quxiaobo0504@hotmail.com。

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2014－05－27)