HPLC—MS—MS測定水產品中的甲基睪丸酮殘留量

馬瑞欣+蘇歡歡+梁艷紅+孫偉彬+郝新麗+張勇

摘 要：在研究基質效應的基礎上，建立了乙酸乙酯提取，石油醚凈化，氘代甲基睪丸酮為內標，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）為流動相，梯度洗脫，高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS-MS）測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的方法。在2.0～500 ng/mL濃度范圍內，線性良好，R2≥0.999；定量限為5.0 μg/Kg。空白樣品添加標準物質后的回收率在75%～105%之間，相對標準偏差≤10%。該方法前處理簡單，可適用于批量水產品中甲基睪丸酮殘留量的快速定性定量檢測。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS-MS）；水產品；甲基睪丸酮；內標法

17-α-甲基睪丸酮（17-αlpha-methyltestosterone）是一種人工合成的雄性激素，水產養殖中使用可提高產量，但在水產動物體內代謝緩慢，其殘留會對人體造成危害。歐盟國家禁止在食品動物中使用甲基睪丸酮及其化合物，我國已經把甲基睪丸酮列入食品動物禁用的獸藥清單[1]。

檢測水產品中甲基睪丸酮殘留量的方法有高效液相色譜法[2]和液質聯用法[3-5]。液相色譜法[2]仍是目前農業部下達水產品抽查任務中的唯一方法，但其存在兩個問題：一是樣品基線干擾大，難以達到10 μg/kg的檢測限，且容易出現假陽性[6]，造成定性和定量的不準確；二是采用乙醚提取，乙醚揮發性很強，易被氧化成過氧化物，過氧化物不穩定，加熱易爆炸，給實驗操作人員帶來一定的安全隱患。雖然有文獻對液相色譜法進行了改進[7-8]，但效果仍不理想。液相色譜-串聯質譜法的測定方法[3-5]前處理需固相萃取凈化，操作步驟太過繁瑣，不適用于實驗室批量檢測任務。

本文在考慮基質效應的基礎上，建立了以氘代甲基睪丸酮（methyltestosterone-D3）為內標，高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的方法。該方法前處理簡單，回收率高，實用性強，可適用于批量水產品中甲基睪丸酮殘留量的快速定性定量檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（Thermofisher，ACCLE-TSQ QUANTUMN ACCESS MAX）；MS3數顯型振蕩器（廣州儀科實驗室技術有限公司）；離心機（湖南湘儀，TDZ5-WS）；旋轉蒸發儀（英國，Bibby，RE300），高速離心機（上海安亭，TGL-16C）；十萬分之一電子天平（德國賽多利斯）；超純水儀（milipore）。

1.2 主要試劑與材料

17-α-甲基睪丸酮（DR，純度98%）；氘代甲基睪丸酮（WITEGA，純度99.5%）；乙酸乙酯（色譜純，B&J）；甲醇（色譜純，fisher）；甲酸（色譜純，DIKMA）；石油醚（色譜純，天津光復）；乙酸銨（色譜純，美國fisher）。實驗所用水為超純水。

甲醇溶液：取80 mL甲醇加入20 mL水。

2 實驗方法

2.1 標準溶液的配制

2.1.1 17-α-甲基睪酮儲備液 準確稱取10.2 mg甲基睪丸酮（純度98%）標準物質，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標準物質儲備液，棕色瓶中-18 ℃保存。

2.1.2 氘代甲基睪酮儲備液 準確稱取5.0 mg甲基睪丸酮標準物質，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標準物質儲備液，棕色瓶中-18 ℃保存。

2.1.3 標準系列的配制 取甲基睪酮儲備液和氘代甲基睪酮儲備液分別用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的溶液，取此溶液用甲醇溶液稀釋成2.0、5.0、10、20、50、100、500 ng/mL的標準系列，內標濃度為100 ng/mL。

2.2 樣品提取

在50 mL離心試管中稱取樣品5.00g，加入1.0 μg/mL的內標溶液200 μL，渦旋混勻30 s，放置30 min后，加入20 mL乙酸乙酯，3 000 r/min渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心3 min，把乙酸乙酯層移入100 mL雞心瓶中。在離心試管中再加入20 mL乙酸乙酯重復提取一次，合并乙酸乙酯，40 ℃旋轉蒸發至干。在雞心瓶中加入2 mL甲醇溶液渦旋振蕩1 min，加入2 mL石油醚，渦旋混合30 s，靜止分層，棄去上層石油醚，再加入2 mL石油醚，渦旋混合30 s，取下層溶液10 000 r/min離心5 min，過0.2 m濾膜后高效液相色譜-串聯質譜聯用儀分析。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：hypersil gold 50×2.1，1.9 μm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相A： 5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）；流動相B：甲醇；流速：250 μL/min；梯度洗脫如表1。

2.3.2 質譜條件

離子化模式：電噴霧正離子模式（ESI+），選擇反應監測（SRM）；噴霧電壓（spray voltage）3 000V；蒸汽溫度（vaperizer temperature）300 ℃；離子傳輸毛細管溫度（capillary temperature）270 ℃；鞘氣（sheath gas pressure）40；輔氣（Aux gas pressure）10。

選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能見表2。

2.3.3 結果計算 測定結果由儀器工作站按照內標法自動計算。樣品中甲基睪丸酮的量按式（1）計算。

3 實驗結果

3.1 定性分析

甲基睪丸酮的定量離子為97.200，定性離子為109.48，其豐度之比在100%±20%之間，則定為陽性。標準溶液離子質量色譜圖見圖1。

圖1 標準溶液（50 ng/mL）特征離子質量色譜圖

3.2 定量分析

圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內，線性良好，R2≥0.999，見圖2。

3.2.2 靈敏度 實驗表明，甲基睪丸酮的檢測限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。

3.2.3 準確度和精密度 分別向對蝦和羅非魚的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標準物質，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個添加水平做平行樣品6個，按上述方法檢測，檢測結果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對標準偏差≤10%，詳見表3。空白樣品和添加標準物質的樣品譜圖見圖3。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

實驗選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標準溶液和用空白樣品提取液配制基質標準溶液來評定基質效應和提取回收率[9-10]，基質為羅非魚，見表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標準溶液，set2： 羅非魚空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標準溶液，set3： 羅非魚空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標準溶液后進行提取，基質效應為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質效應越嚴重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質效應小；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實驗表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標化合物周圍無干擾物質存在。

4.2 凈化溶劑的選擇

實驗發現：用空白樣品提取液配制的標準溶液（基質標準溶液）經正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見表5。而石油醚萃取后基質標準溶液的峰面積基本無變化。因此本實驗利用石油醚進行除雜凈化。

4.3 實驗方法的確定

由于基質效應比較嚴重，本文采用內標法進行檢測，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動相，梯度洗脫，以降低基質效應的影響。

5 結論

在考察基質效應的基礎上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內標法測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的高效液相色譜-串聯質譜法。該方法前處理簡單，準確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國水產品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實驗室中甲基睪丸酮的批量檢測。

參考文獻：

[1] 全國水產標準化技術委員會. NY 5071-2002 無公害食品 漁用藥物使用準則[S].北京：中國標準出版社，2002

[2] 全國水產標準化技術委員會水產品加工分技術委員會. SC/T 3029-2006 水產品中甲基睪酮殘留量的測定 液相色譜法[S]. 北京：中國農業出版社，2006

[3] 聶建榮，李大光，鄧香連，等. LC-MS/MS法同時測定動物源性食品中甲基睪丸酮和己烯雌酚的 方法研究[J]. 中國獸藥雜志，2009，43（4）：20-24

[4] 祝璟琳，楊弘，肖煒，等. 超高效液相色譜-串聯質譜聯用測定羅非魚肌肉中甲基睪丸酮殘留[J].食品科學，2011，32（22）：243-247

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[7] 秦振發，黎小正. 硅膠柱SPE-HPLC測定水產品中甲基睪酮的研究[J].食品科技，2009，34（10）：291-294

[8] 陳培基，李劉冬，鄒琴，等.高效液相色譜法測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的優化研究[J].食品科學，2010，31（6）：223-226

[9] 趙建暉，唐慶強，吳文凡，等.固相萃取-超高效液相色譜-質譜聯用法測定水產品中左氧氟沙星殘留[J]. 福建分析測試，2011，20（5）：15-19

[10] 王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯質譜測定豬組織中β-興奮劑殘留的基質效應[J].分析化學研究簡報，2013，40（9）：1445-1449

圖1 標準溶液（50 ng/mL）特征離子質量色譜圖

3.2 定量分析

圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內，線性良好，R2≥0.999，見圖2。

3.2.2 靈敏度 實驗表明，甲基睪丸酮的檢測限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。

3.2.3 準確度和精密度 分別向對蝦和羅非魚的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標準物質，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個添加水平做平行樣品6個，按上述方法檢測，檢測結果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對標準偏差≤10%，詳見表3。空白樣品和添加標準物質的樣品譜圖見圖3。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

實驗選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標準溶液和用空白樣品提取液配制基質標準溶液來評定基質效應和提取回收率[9-10]，基質為羅非魚，見表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標準溶液，set2： 羅非魚空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標準溶液，set3： 羅非魚空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標準溶液后進行提取，基質效應為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質效應越嚴重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質效應小；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實驗表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標化合物周圍無干擾物質存在。

4.2 凈化溶劑的選擇

實驗發現：用空白樣品提取液配制的標準溶液（基質標準溶液）經正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見表5。而石油醚萃取后基質標準溶液的峰面積基本無變化。因此本實驗利用石油醚進行除雜凈化。

4.3 實驗方法的確定

由于基質效應比較嚴重，本文采用內標法進行檢測，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動相，梯度洗脫，以降低基質效應的影響。

5 結論

在考察基質效應的基礎上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內標法測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的高效液相色譜-串聯質譜法。該方法前處理簡單，準確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國水產品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實驗室中甲基睪丸酮的批量檢測。

參考文獻：

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圖1 標準溶液（50 ng/mL）特征離子質量色譜圖

3.2 定量分析

圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內，線性良好，R2≥0.999，見圖2。

3.2.2 靈敏度 實驗表明，甲基睪丸酮的檢測限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。

3.2.3 準確度和精密度 分別向對蝦和羅非魚的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標準物質，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個添加水平做平行樣品6個，按上述方法檢測，檢測結果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對標準偏差≤10%，詳見表3。空白樣品和添加標準物質的樣品譜圖見圖3。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

實驗選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標準溶液和用空白樣品提取液配制基質標準溶液來評定基質效應和提取回收率[9-10]，基質為羅非魚，見表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標準溶液，set2： 羅非魚空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標準溶液，set3： 羅非魚空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標準溶液后進行提取，基質效應為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質效應越嚴重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質效應小；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實驗表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標化合物周圍無干擾物質存在。

4.2 凈化溶劑的選擇

實驗發現：用空白樣品提取液配制的標準溶液（基質標準溶液）經正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見表5。而石油醚萃取后基質標準溶液的峰面積基本無變化。因此本實驗利用石油醚進行除雜凈化。

4.3 實驗方法的確定

由于基質效應比較嚴重，本文采用內標法進行檢測，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動相，梯度洗脫，以降低基質效應的影響。

5 結論

在考察基質效應的基礎上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內標法測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的高效液相色譜-串聯質譜法。該方法前處理簡單，準確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國水產品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實驗室中甲基睪丸酮的批量檢測。

參考文獻：

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[5] 鄭重鶯，王揚，周凡，等. 高效液相色譜-串聯質譜測定羅非魚中甲基睪丸酮殘留[J].中國漁業質量與標準，2013，3（3）：78-82

[6] 陳俊.高效液相色譜法檢測水產品中甲基睪丸酮的假陽性分析[J].南方水產，2010，6（6）：74-76

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[8] 陳培基，李劉冬，鄒琴，等.高效液相色譜法測定水產品中甲基睪丸酮殘留量的優化研究[J].食品科學，2010，31（6）：223-226

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[10] 王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯質譜測定豬組織中β-興奮劑殘留的基質效應[J].分析化學研究簡報，2013，40（9）：1445-1449