酶聯免疫法測定水產品中呋喃唑酮代謝物殘留量

2014-08-27 21:12:54葛懷禮蒙君麗宋蓀陽李愛軍董李學

河北漁業 2014年8期

葛懷禮+蒙君麗+宋蓀陽+李愛軍+董李學

摘要：為測定水產品中呋喃唑酮代謝物（AOZ）的殘留量，采用2-硝基苯甲醛進行衍生，乙酸乙酯提取AOZ。通過樣品中殘留的AOZ和酶標板上預包被的抗原競爭抗體，加入酶標二抗后與底物顯色，測得樣品中AOZ的殘留量。測定了四組水產品中AOZ的殘留量，測定濃度均小于1 μg/kg，結果為陰性。向空白樣品中分別添加0.5 μg/kg、1.5 μg/kg 和2 μg/kg的AOZ標準品，回收率為90%、109%和101%。因此得出結論：采用酶聯免疫法測定水產品中AOZ殘留量操作簡單，檢測時間短，結果準確，是一種適合大批量水產樣品篩選的檢測方法。

關鍵詞：酶聯免疫法；水產品；呋喃唑酮代謝物；殘留量

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，常用于水產動物疾病的治療。常見的硝基呋喃類藥物主要指呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，它們的代謝產物分別為AOZ、AMOZ、AHD和SEM[1]。硝基呋喃類藥物在體內代謝分解迅速，很難直接檢測。而其代謝產物大部分與蛋白質緊密結合，在體內殘留時間較長且較為穩定[2]，采用普通的加工方法也很難使其大量降解。因此一般采用對硝基呋喃類代謝產物的檢測[3-5]，以達到硝基呋喃類藥物的管理和監控目的。

呋喃唑酮代謝物（AOZ）為硝基呋喃類藥物中最具代表性的一種，目前各國對呋喃唑酮的使用都有嚴格的規定。歐盟規定動物源性食品中不得檢出硝基呋喃（包括呋喃唑酮）。美國 1993年禁止呋喃唑酮作為獸藥。我國農業部農牧發[2002]1號《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中規定動物源性食品中呋喃唑酮不得檢出。最常用的檢測呋喃唑酮的方法主要有：酶聯免疫法（ELISA）[6-7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[9]。酶聯免疫法測定呋喃唑酮代謝物具有精密度和靈敏度較高、檢測時間短、且檢測樣本量大等特點。

1 材料與方法

1.1 材料及設備

1.1.1 實驗材料鰱魚、牙鲆、鯉魚和草魚，均來源于唐山市各縣市區水產養殖場及水產公司。

1.1.2 試劑及主要設備乙酸乙酯，正己烷，三水合磷酸氫二鉀，濃鹽酸，氫氧化鈉，以上試劑均為分析純。

酶標儀 Thermo MK3；氮氣吹干儀（天津艾維歐科技發展有限公司）；恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；均質機（天津市太斯特儀器有限公司）；渦旋儀（上海躍進醫療器械廠）；微量移液器 Thermo Electron；AOZ酶聯免疫試劑盒（北京望爾生物技術有限公司生產，靈敏度：0.025 μg/kg，最低檢測限：0.1 μg/kg）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理選取鰱魚、牙鲆、鯉魚和草魚四類樣品，剔去魚皮、魚骨和內臟，取魚肉部分均質備用。稱取1.00 g±0.05 g已均質樣品于50 mL離心管中，分別加入4 mL 去離子水，0.5 mL 1 mol/L鹽酸，100 μL衍生化試劑，充分振蕩，置于37 ℃孵育16 h。分別加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鉀、0.4 mL 1 mol/L氫氧化鈉和5 mL乙酸乙酯，充分振蕩， 4 000 r/min離心 10 min。取2.5 mL乙酸乙酯相于10 mL玻璃試管中，50 ℃ N2吹干。加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL復溶液，振蕩混合，4 000 r/min 離心10 min，除去上層有機相，取下層水相50 μL用于分析。

2.2.2 檢測步驟取出試驗所需數量的微孔板條，插入框架。將樣品和標準品對應微孔按序編號，并記錄標準孔和樣品孔所在位置。加入50 μL的標準液、樣品到對應微孔中。然后加入抗體工作液50 μL，輕輕震蕩混勻后于室溫下避光環境中反應30 min。甩出孔中液體，每孔每次用250 μL洗滌液洗板3～5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干。加入酶標二抗溶液100 μL（將酶標二抗濃縮液用復溶工作液按照1∶10進行稀釋），充分混勻，用蓋板膜蓋板后于避光環境中反應30 min。重復洗板。每個孔中加入底物A溶液50 μL，再加底物B溶液50 μL輕輕振蕩混勻，室溫環境下避光反應15 min。每孔加終止液50 μL，振蕩混勻，酶標儀在波長450 nm/630 nm處讀取OD值。

1.3 結果計算

1.3.1 百分吸光率的計算樣品或標準品的百分吸光率等于標準品或樣品的吸光度的平均值（B）除以0 μg/kg標準的吸光度值（B0），再乘以100%。

1.3.2 標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率的對數為縱坐標，以AOZ標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線中讀出樣品所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣品中AOZ的實際濃度。本實驗采用試劑盒專業分析軟件進行繪制標準曲線和樣品濃度的計算。

1.3.3 回收率的計算添加AOZ樣品的計算濃度（x1）減去空白樣品中AOZ的濃度（x0）除以實際添加AOZ的濃度（x），再乘以100%。

2 結果與討論

2.1 樣品衍生化與前處理

在AOZ的檢測中，一般先加入衍生化試劑進行衍生。AOZ衍生過程反應如圖1所示。這主要是由于呋喃唑酮的代謝物AOZ的分子量較小，不易被檢測。而在37 ℃酸性條件下，加入衍生化試劑2-硝基苯甲醛后，形成衍生產物2-NP-AOZ，分子量增大，大大提高了檢測靈敏度。

2.2 標準曲線繪制和樣品殘留量測定

分別向微孔中添加濃度為0 μg/kg、0.025 μg/kg、0.075 μg/kg、0.225 μg/kg、0.675 μg/kg、2.025 μg/kg的標準品，以標準品百分吸光率的對數為縱坐標，以AOZ標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線如圖2，制得標準曲線為y=-0.844 3 ln（x）-1.708 1，R2=0.998 3。

本實驗選取四組、共12批水產魚類樣品，分別為鰱魚、牙鲆、鯉魚和草魚。經樣品前處理后，采用酶聯免疫法進行分析，測得其中AOZ的濃度，結果如表1所示。數據顯示四組水產樣品濃度均小于1 μg/kg，依據農業部公告第235號進行判定，結果呈陰性。其中第一組鰱魚樣品中測得的AOZ的濃度較小，均小于0.05 μg/kg。而第二組牙鲆樣品中AOZ濃度均大于其他三組。這可能是由于牙鲆為海水魚，其他三組均為淡水魚。有研究表明，海水養殖場出水口附近的海水及底泥可能有硝基呋喃類代謝物殘留[10]。這可能是導致牙鲆中AOZ含量稍高的原因之一。采用LC-MS-MS方法對這四組水產品進行確證檢測，所得結果均為陰性。說明采用該試劑盒方法所檢測的樣品結果無假陰性。

2.3 回收率和相對標準偏差

分別向空白魚肉中添加0.5、1、2 μg/kg的標準溶液，經計算回收率和相對標準偏差（RSD）結果如表2所示。結果顯示，添加樣品的回收率均控制在90%～110%之間，RSD值小于5%。說明采用該試劑的方法能夠有效檢測水產品中AOZ。

3 結論

通過樣品衍生化和乙酸乙酯提取AOZ，采用酶聯免疫試劑盒的檢測方法，測得四組水產樣品，所得結果均為陰性。與LC-MS-MS檢測結果一致。說明該試劑盒的檢測結果無假陰性。在空白樣品中添加不同濃度水平的AOZ標準液，回收率在90%～110%之間。該試劑盒的方法能夠有效檢測水產品中AOZ的殘留量。酶聯免疫法操作簡便，檢測時間短，可以作為實驗室樣品的快速篩選方法。但是由于酶聯免疫法的結果有可能出現假陽性，無法作為最后的確證結果，實驗結果還需要液相色譜串聯質譜方法進行確證。

參考文獻：

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