糖尿病并發膽囊結石病人CCK受體表達意義的探討

張紅裔，金 虎，戴春雷，李 丹，翟春亮，王中會，李亞剛

(吉林大學第四醫院·一汽總醫院，吉林 長春130011)

縮膽囊素(CCK)是一類廣泛分布于消化系統和中樞神經系統的內源性多肽,在消化系統中可調控胃酸和胰酶分泌、胃排空等生理過程[1,2]。依據介導的生理功能不同,CCK 受體被分為 CCK-1(主要分布在消化系統)和CCK-2(主要分布在 CNS)兩種亞型。CCk受體的作用是受FGF19拮抗的，FGF19是在餐后1-2 h引起膽囊舒張，FGF19和CCK的交替作用引起膽囊的舒張和收縮。TGR5是G蛋白偶聯受體，受初級及次級膽汁酸激活，與FGF19一起作為近距離和遠距離兩個機制共同調節膽囊的餐后的再充盈，膽囊的運動障礙是膽囊膽固醇結石形成原因之一，糖尿病病人 CCK受體受損導致膽囊收縮力減弱及膽囊的過度充盈，無疑會導致膽囊運動障礙，膽汁淤積，從而使膽固醇結晶析出，結石形成。本實驗通過前瞻性病例對照研究，探討糖尿病病人膽囊膽固醇結石的成因。

1 臨床資料

1．1一般資料

對照組：獲取正常膽囊組織標本時間相對較長，這些標本作為很好的對照，它們是從那些沒有膽道及肝臟疾病的病人行腹部手術時獲得，手術同樣也是標準的膽囊切除術。有下列之一者排除在外：①B超檢查膽囊結石、膽囊息肉、急性或慢性膽囊炎等膽囊疾患；②膽管結石、急性或慢性胰腺炎：③糖尿病病人；④迷走神經切斷術及胃大部切除(畢Ⅰ及畢Ⅱ)術等上腹手術史；⑤近期曾使用過可能會影響膽囊收縮的藥物，如紅霉素、膽酸鈉、生長抑素。

膽固醇結石組積及膽色素結石組(病理組)：收集2001年6月-2003年1月我院肝膽外科腹腔鏡膽囊切除術55例，其中膽囊膽色素結石患者(實驗組)20例；膽囊膽固醇病變患者19例。入選條件①術后病理證實膽囊膽固醇及膽色素結石；②無癥狀或僅有輕微癥狀的膽囊結石患者；③無明顯的膽絞痛和急性膽囊炎發作史；④不合并有膽囊息肉、膽囊惡性病變等；⑤無膽囊結石嵌頓；⑥無膽總管結石；⑦無急或慢性胰腺炎；⑧無迷走神經切斷、胃大部切除等上腹手術史；⑨近期未曾使用過可能會影響膽囊收縮的藥物，如紅霉素、膽酸鈉、生長抑素等等。

1.2標本的采集

①術前由同一超聲診斷醫師測定膽囊排空功能，術中取出膽囊，取膽汁1 m1及頸部膽囊壁組織，分別置于無菌管內，于30 min內置于-70℃冰箱保存。②膽囊標本采取：從有膽囊切除適應癥的手術中獲得新鮮的膽囊組織標本。病人信息見表1.標本隨機獲取，膽固醇結石的膽囊組織標本和膽色素組織標本獲取的比例同流行病學的比例大致相同。當膽囊切除后后立即剪下1.0 cm×1.0 cm 大小全層膽囊壁組織2-3 塊,用無菌生理鹽水沖洗3遍后裝入 Eppendorf 管,立即置入小型手提式液氮罐中,30 min內送至實驗室,置于零下85℃低溫冰箱冷凍持續恒溫保存待測。

2 材料與方法

2.1方法

2.1.1 膽囊排空功能測定 受檢者禁食8-12 h后行超聲檢查，凍結后用同時觀察膽囊內有無膽汁淤積、結石形成及膽垂壁是否粗糙。脂肪餐是用花生油25-30 g煎雞蛋兩個．讓受試者于10 min內進食完，餐后1、2、3、4 h分別測膽囊大小，在手術前，使用超聲分別在餐前和餐后不同時段對膽囊的最大長度、寬度和直徑進行測量。應用彩色超聲 Mindray DC-8/DC-8，超聲的探頭從右側肋間隙進入，排除結腸氣體的干擾，選擇正確的角度以獲得膽囊的最大的直徑，測得數據后應用Dodds’[1]公式測量膽囊體積：V=π/6xL×W×D。空腹體積用V0表示，餐后2 h膽囊體積用V2表示，膽汁排泄量使用如下公式計算EV= V0- V2。餐后2 h的膽囊排空指數GBEF=(V0-V2)/V0×100%。

2．2RT-PCR測定CCK的表達

分別從實驗組和對照組取膽囊平滑肌標本，提取標本、擴增、凝膠電泳，以觀察CCK-A、 TGR5、 FGF19及其表達。

2.2.1 藥品與試劑 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) i.組織中總RNA的提取：①從液氮中取出膽囊組織，用剪刀迅速剪取組織放入 1.5 ml 的DEPC水處理過的 Eppendroff 管中，每25-50 mg的組織中加入 500 μl Trizol，用研磨棒研磨組織使Trizol與其充分接觸。②室溫靜置 5-10 min，以充分裂解組織。③加入100 μl 三氯甲烷，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s后室溫靜置2-3 min。④ 4℃，12 000 g，離心15 min，此時可觀察到管中分三層：下層為紅色的氯仿相，中間為白色的薄層，上層為無色的水相(約占總體積的50%)，小心將上層水相移入一個新的 1.5 ml 的DEPC水處理過的 Eppendroff 管中，注意不要吸入水相以外的溶液。⑤加入與上層水相等體積的異丙醇，輕輕混勻后，室溫靜置10 min，然后4℃ ， 12 000 g，離心10 min，離心后，棄去上清，留下沉淀。⑥加入 1 ml 75%乙醇(用DEPC水現配)以清洗 RNA 沉淀，溫和震蕩 離心管懸浮沉淀，4℃，7 500 g，離心5 min，然后盡量棄去清洗液。⑦室溫放置 5-10min 以干燥 RNA 至半透明狀。⑧DEPC 水溶解 RNA，加30 μl，一般加(30-100 μl)反復輕輕吹打若干次，然后放于55-60℃的水浴鍋中水浴 10 min。取1 μl充分溶解后的 RNA 溶液，檢測其 OD260/OD280 比值，計算出RNA 濃度。ii.逆轉錄反應(RT)：①反應體系：樣本RNA (1 μg/μl) 5 μl；5×RT Buffer 8 μl; Oligo dT-Adaptor Primer(125 ng/μl) 2 μl ;dNTP Mixture(10 mM) 2 μl;RNase Inhibitor 0.3 μl;MMLV Reverse Transcriptase(200 U/μl) 1 μl;RNase Free ddH2O 41.7 μl;Total 40 μl。②反應條件：42℃ 1 h;70℃ 10 min;4℃ 5 min;反應結束后，將產物放置-20攝氏度。iii.聚合酶鏈式反應(PCR):①反應體系：2 的反應產物(RT產物) 4 μl;上游引物(10 mM) 1 μl;下游引物(10 mM) 1 μl;2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl;dd H2O 6.5 μl;Total 25 μl。人CCKR 引物：上游引物：GCGTGGTGCGAATGTTGC；下游引物：CAGCCTGTTGGTCAGAGGTATG;片段長度：827 bp，退火溫度：58℃;人 FGF19 mRNA:上游引物：CTCGGAGGAAGACTGTGCT;下游引物：TGGAGGGATTTGGGAAGG;片段長度：832 bp，退火溫度：56℃; 人TGR5 引物：上游引物：5‘-GGCAAGCCTCATCATCACC-3’;下游引物：5‘-CGGGCAGACTGGCAAAGA-3’;片段長度：356 bp， 退火溫度：60℃。②反應條件：

iv.取 5 μl 3的產物(PCR產物)進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，凝膠成像分析儀分析結果。

瓊脂糖凝膠電泳:①稱取 0.15 g瓊脂糖倒入小錐形瓶中，再量取15 ml的1×TAE倒入其中，混勻。②微波爐中加熱1 min至完全溶解，，室溫下冷卻至 60℃左右(期間可以把膠模準備好)，加入 7.5 μlEB(溴化乙錠)，終濃度為 0.5μg/ml，充分混勻。③將混勻的凝膠緩慢倒入已準備好的插有梳子的膠模中，凝膠的厚度在 3-5 mm 之間。注意不要產生氣泡。若產生氣泡則迅速用槍頭刺破。④室溫放置 30 min左右，待膠完全凝固后，小心拔出梳子，注意用力要均勻，以免破壞上樣孔。⑤將凝膠小心放入水平電泳槽，倒入電泳緩沖液， 液面應高出凝膠表面 2 mm左右。⑥按設計好的順序每孔加入 5 μl PCR 產物和DL-2000 Marker。⑦蓋好電泳槽蓋，接通電源，調節電壓至 100 V，時間 25-30 min。⑧電泳結束后，取出凝膠，放到凝膠成像分析儀中，觀察結果，拍照保存，并進行灰度值分析。

2.3統計學分析

數據結果利用spss13軟件，對非配對的組間值采用 t-檢驗進行分析，變量間相互關系采用雙變量線性相關分析。

3 結果

膽囊排空功能統計學結果及CCK-A 、TGR5及FGF19受體mRNA的擴增結果統計學分析：

表1是各組膽囊不同時段的膽囊的容積值，餐后2小時達到最大收縮，表2是組間各變量值。糖尿病病人的膽固醇結石組膽囊排空能力與正常膽囊組及無糖尿病膽色素組相比較，明顯低于正常膽囊組及無糖尿病組，差異有顯著性。無糖尿病膽色素結石組與正常膽囊組相比較,低于對照組，但無統計學意義，提示膽色素結石成因與膽固醇結石成因機制不同。其糖尿病膽固醇結石組組CCK受體 mRNA 相對表達量，明顯低于正常膽囊對照組及無糖尿病膽色素結石組。無糖尿病膽色素結石組膽囊CCK受體 mRNA與及正常膽囊對照組相比較,低于對照組，但無統計學意義。應用雙變量線性相關分析法分析組內各變量間相互關系,我們發現膽囊結石患者中的膽囊平滑肌細胞膜 CCK 受體 mRNA 表達與膽囊殘余指數，二者呈負相關，而膽囊的餐前最大充盈與TGR5及FGF19呈正相關關系。

表1 空腹及餐后各時段膽囊容積

表2 組間各變量值

(注：EV2：餐后2小時的膽囊膽汁排泄量。GBEF2：餐后2小時膽囊排空指數。GBEF4：餐后4小時膽囊排空指數)

4 討論

膽囊結石的成因復雜，膽囊收縮力的減低，膽囊內膽汁淤積有利于結石的形成。在長期禁食超過3個月的完全腸外營養的患者中有超過45%的成人和43%的兒童發生膽囊結石，這說明膽囊動力障礙可能是膽囊結石形成的重要因素之一。膽囊結石病人膽囊收縮功能障礙的機制雖然尚未闡明，但有研究表明膽囊壁CCK-A受體數量的減少可能是膽囊結石病人中膽囊收縮功能受損的致病環節之一[3]。膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)最初發現于胃腸道，并作為胃腸激素調節胰腺的生長和分泌以及胃和膽囊的收縮功能CCK一方面直接參與糖尿病的發生，通過引起糖尿病而促進膽囊結石的發生，另一方面CCK及其受體本身異常也導致了膽囊結石形成。CCK在血液循環中有4種不同長度的肽鏈形式：CCK-8、CCK-33、CCK-39、CCK-5，其中以CCK-8的生理效應最大，其生物學效應通過膽囊平滑肌表面的CCK受體實現，本組研究表明糖尿病合并膽囊結石的CCK-受體 mRNA 表達明顯低于正常病人組，結石無糖尿病組接近正常病人的表達，CCK—受體 mRNA表達與糖尿病合并膽固醇結石的膽囊排空能力呈正相關，這在基因水平上支持CCK受體在膽囊結石形成中的重要作用。罹患膽固醇結石的患者因為其CCK受體減少而至膽囊收縮功能受損，膽汁中脫氧膽酸含量增加，腸肝循環減慢，促進膽汁中膽固醇增加，最后達到過飽和。膽固醇含量增高、粘蛋白分泌和脫氧膽酸鹽增加，促使膽固醇結晶的析出，從而逐漸形成膽囊結石。膽固醇結晶析出，進而進一步形成結石，這與目前的相關研究結果一致[4-6]。Fridhandler在動物實驗中觀察到40%的土撥鼠在膽囊結石形成前，膽囊的收縮就已經發生了改變；結石形成后，收縮減弱者達65%。膽囊收縮力的減弱與膽囊對CCK及乙酰膽堿的最大反應不相關，說明在成石過程中膽囊收縮的減退是結石形成的因素，而不是結果。研究發現等通過檢測膽石癥患者術后2 周的血漿CCK-8 水平基本恢復正常,這也說明了在去除負反饋源后,CCK的合成、分泌趨于正常，說明膽囊平滑肌上的受體表達減少負反饋引起血中的CCK-8的升高。膽囊CCK受體的破壞是由于膽汁中膽固醇過多或由于膽固醇在膽囊壁內平滑肌的分泌沉積，當膽囊平滑肌暴露于富含膽固醇的環境時，膽固醇可通過擴散和胞飲作用，進入膽囊平滑肌細胞，并與之結合。高濃度膽固醇產生細胞膜毒性作用，影響細胞膜上CCK受體的正常表達，導致CCK生理效應減低，從而導致膽囊收縮力障礙。傅華群等[2]等證實了膽固醇可影響CCK受體的調節，膽囊膽固醇結石形成的機制中亦包括膽道及膽囊膽固醇分泌。亦有研究分析造成膽囊膽固醇結石形成原因可能是:①膽囊黏膜黏液分泌過多使得膽囊管的阻力增加,造成膽汁排空障礙[7]②當膽囊平滑肌長期暴露于富含膽固醇的環境中,膽固醇可通過擴散和胞吞作用進入膽囊平滑肌細胞膜而[8]與之結合,這種擴散具有濃度依賴性。高濃度膽固醇產生細胞膜毒性效應,影響肌細胞膜上的 CCK受體[9]表達,從而導致 CCK生理效應的減低。但膽囊結石到目前為止，其發病的機制尚不完全清楚，除了“膽囊內膽汁膽固醇過飽和、成核”理論和“ 膽固醇磷脂泡”理論外，近年來的研究日益重視膽囊的病理改變在膽固醇結石形成中的作用，認為膽石的形成并不完全依賴于膽汁物理化學方面的改變，膽囊自身尤其是膽囊收縮功能在膽固醇結石的形成中起著非常重要的作用。動脈壁游離膽固醇沉積導致Ca離子的內流及外流受限，從而使血管平滑肌細胞膜的流動性降低同時收縮運動功能減弱。膽囊平滑肌的膽固醇微泡結合并扣押CCK受體從而達到減弱膽囊收縮力的作用，而非毒性作用，CCK受體的總數沒有改變，只是相當一部分CCk受體不能發揮作用，而且這種失效是可逆的。最新研究顯示除了膽囊收縮功能障礙，膽囊的過度充盈同樣是膽囊膽固醇結石形成的因素之一。空腹膽囊體積與膽囊結石本研究通過超聲觀察實驗對象中空腹膽囊體積變化及膽囊收縮比率，結果表明，空腹膽囊膽固醇結石組實驗膽囊體積擴大，膽囊收縮率明顯低于空腹正常對照組，差異有顯著性。說明膽囊體積擴大，膽囊收縮功能降低可能與膽囊平滑肌功能缺陷有關。膽石患者的空腹膽囊體積增大，收縮率下降，膽汁在膽囊內淤積時間相對較長，為結石產生提供了條件。膽固醇除膽固醇代謝紊亂外還可通過膽堿能受體、CCK受體及Ca2+通道等影響膽囊動力，促進膽固醇結石形成。 TGR5是G蛋白偶聯細胞表面受體由初級膽汁酸和次級膽汁酸激活，激活順序是致石膽酸(LCA)>去氧膽酸>鵝去氧膽酸>膽酸[10]。研究表明，有兩個機制控制膽囊的充盈，一個是遠距離調控機制，FGF15/19由回腸的膽汁酸引發，代表遠距離信號調控機制引起餐后的膽囊的再充盈。另一個是近距離信號調控機制，TGR5受局部膽汁酸濃度影響調整膽囊的餐后充盈。TGR5通過膽囊上皮纖維跨膜調節引起氯離子濃度升高，從而調節膽囊的充盈[10]。本實驗結果顯示糖尿病人的膽囊TGR5表達明顯高于正常膽囊及非糖尿病人，且與膽囊的過度充盈呈正相關性，FGF19在糖尿病病人膽囊的表達與正常膽囊組織的表達差別顯著，而與無糖尿病患有膽囊結石的膽囊之間差異無統計學意義，我們得出可能的結論是，在膽汁酸腸肝循環中，膽汁酸在回腸末端被吸收時能刺激腸細胞分泌FGFl9．經門靜脈循環系統進入肝臟，進而對膽汁酸合成進行負反饋調節，主要是通過對肝臟膽汁酸合成關鍵酶——膽固醇7α羥化酶起到負反饋抑制作用，使膽汁酸池減少，從而使TGR5分泌增加，進一步導致膽囊的過度充盈，膽固醇晶體析出，結石形成。未來進一步研究可能會揭示TGR5 和FGF15/19是如何相互協調控制膽囊餐后充盈。

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