比較蛋白質組學在腫瘤生物標記物研究中的應用策略

孫寧寧，高 祥，李玲霞，宋麗娜，李曉鷗，王子健，劉 寧*，武利濤

(1.吉林大學第二臨床醫院，吉林 長春130041； 2.吉林大學中日聯誼醫院；3.吉林省腫瘤醫院；4.北京中醫藥大學東直門醫院醫學工程科)

腫瘤是由多重因素引起的復雜疾病，受多種基因的調控。基因的表達方式錯綜復雜，從mRNA表達水平并不能準確預測蛋白質的表達水平，蛋白質的動態修飾和加工并非必須受基因序列的調控。而且蛋白質是細胞功能的真正執行者，可以動態反映生物系統，腫瘤細胞的形成必然涉及蛋白質組的變化。因此，利用蛋白質組學技術研究具有臨床應用價值的腫瘤生物標記物具有重要的意義。其核心研究思路是通過分析腫瘤細胞/組織等樣品中的蛋白質組，尋找腫瘤患者與正常人的蛋白質組的異同。所采取的技術方法-基于雙向電泳—質譜(MS)分析的技術-具有精確、靈敏、重復性好等優點，現在已廣泛應用于腫瘤生物標記物的研究。本文主要對近年來基于雙向電泳—質譜的蛋白質組學分析方法在研究蛋白類腫瘤生物標記物方面進行綜述。

1 腫瘤生物標記物的主要類型

腫瘤的生物標記物(該文中的腫瘤生物標記物特指蛋白類腫瘤生物標記物)主要有3類：腫瘤特異抗原、腫瘤相關抗原、腫瘤引起的自身抗體[1,2]，它們產生于腫瘤的發生及發展過程中。腫瘤特異抗原是腫瘤所特有的抗原，在正常細胞中不存在。腫瘤相關抗原在腫瘤細胞與正常細胞中都存在，在相同條件下，蛋白類腫瘤相關抗原在腫瘤患者與健康人體內可能會存在表達量的差異，而且在腫瘤生長的不同時期也可能會存在表達量的差異。腫瘤引起的自身抗體為腫瘤相關抗原導致機體免疫產生的自身抗體[3]。因而，自身抗體可以作為探針研究腫瘤相關抗原[4]。在腫瘤早期異常蛋白豐度極低，如果該蛋白引起體液免疫應答，則會產生相對過量的抗體并存在于血液中，便于檢測[5]，所以自身抗體對腫瘤的診斷會更為靈敏[6]?？傊?，它們都可以作為腫瘤的生物標記物表征檢驗者的患病系數或患病程度等指標。

2 基于雙向電泳—質譜的蛋白質組學方法

雙向電泳是蛋白質組學中最常用的膠分離技術，它是將等電聚焦電泳與聚丙烯酰胺凝膠電泳結合，根據蛋白質等電點及分子量的不同，將大量不同的蛋白質進行分離的技術。凝膠染色后的蛋白質呈現二維分布圖，水平方向表示蛋白以等電點分離的結果，而垂直方向表示蛋白組以分子量分離的結果。雙向電泳具有較高的分辨率，可用于比較細胞或組織在不同狀態下蛋白質組的變化[7-10]。經雙向電泳分離的蛋白質點可以通過質譜對其進行鑒定，也可以對蛋白質的翻譯后修飾進行表征。

3 基于雙向電泳—質譜的蛋白質組學方法在蛋白類腫瘤生物標記物研究中的應用

目前，已有多種方法應用于腫瘤生物標記物的研究，如免疫組織化學技術、細胞免疫技術、膠分離技術、蛋白芯片、質譜等。其中，基于雙向電泳—質譜的蛋白質組學方法借助其快速、靈敏、精確的優勢，在腫瘤生物標記物的研究中得到了廣泛的應用[11,12]。

3.1應用于腫瘤特異抗原研究的主要技術路線

該技術路線(圖1 (A))主要通過雙向電泳的方法分離蛋白質組，從而發現腫瘤特異抗原。首先，將腫瘤與正常組織或細胞進行樣本處理，獲得蛋白樣品。通過蛋白定量確定樣品濃度進行雙向電泳，即首先根據蛋白質的等電點不同進行等電聚焦電泳(IEF)，使蛋白質定位于pH梯度膠條的特定位置，然后根據蛋白質的分子量不同進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使同一等電點的蛋白質由于分子量不同而得到分離。雙向電泳凝膠內的蛋白質可根據實驗目的的不同選擇合適的染色方法，如Blue silver、銀染、鋅染等。直接染色的凝膠經掃描獲得蛋白質表達圖譜，通過分析軟件比較實驗組與對照組的異同，尋找異常蛋白點。然后將差異蛋白斑點取出，進行膠內酶切及肽段提取，最后使用質譜方法檢測肽段信息。質譜儀所得到的肽段信息可以通過蛋白質數據庫進行比對。如果與所研究肽段的氨基酸序列完全匹配，則該蛋白未經修飾，為已知蛋白；否則可通過多肽圖譜的峰值變化判定所研究的蛋白為修飾的已知蛋白或一種新的蛋白質。

Giribaldi G等人采用該技術路線分析方法，發現了腎細胞癌潛在的生物標記物—內質網鈣結合蛋白1(RCN1)[13]。首先，通過2-DE和MALDI-TOF MS(基質輔助激光解吸-飛行時間質譜儀)的檢測，發現RCN1在所有的腫瘤樣本中都過量表達。然后通過Western Blot 及免疫組織化學的方法驗證了這一結論，對以后腎細胞癌的深入研究及臨床診斷的應用作出了貢獻。

和平[14]等人采用以上路線研究肺腺癌生物標記物，發現94 ku葡萄糖調節蛋白(grp94)等6種差異蛋白，為以后尋找肺腺癌特異性腫瘤生物標記物提供參考。

3.2應用于腫瘤相關抗原及自身抗體研究的主要技術路線

僅從技術方面來看，該技術路線與檢測腫瘤特異抗原的方法相似，但這兩種方法在本質上存在很大的差異(圖1 (B))。該技術路線主要使用免疫學的方法研究腫瘤生物標記物。與上述路線的不同之處是將未經染色的凝膠轉膜后，使用病人血清進行免疫印跡(Western Blot)， 分析實驗組與對照組的蛋白特征。如果實驗組(腫瘤組織/細胞提取液)顯示具有差異蛋白點，則可將該膜切割取點，提取的蛋白進行酶消化后質譜分析。但是，蛋白經過免疫印跡多步處理后，蛋白會部分損耗，而且膜經過封閉液處理后，切取的膜會帶有相對過量的雜蛋白(封閉液中的蛋白)，這必然會影響質譜分析結果。所以，目前獲取該差異蛋白往往取自直接染色的凝膠，即與實驗組平行的雙向電泳(其中一塊膠用于Western Blot，另一個用于直接染色)，最后切取與膜上相對應的凝膠蛋白斑點。

現在，很多科研工作者使用血清蛋白質組學的方法研究腫瘤相關抗原及自身抗體。Hamrita B[15]等人通過上述主要路線研究乳腺癌，肯定了血清蛋白質組學用于腫瘤相關抗原及自身抗體研究的可行性。通過分析比較實驗組與對照組，發現了5個潛在的腫瘤相關抗原，并且首次鑒定了乳腺癌患者血清中存在抗Prx-2的自身抗體。

(A)研究腫瘤特異抗原的技術路線；(B)研究腫瘤相關抗原及自身抗體的技術路線

當然，以上述兩條主線為基礎，還可以設計更加完善的研究方法:①樣本來源：樣本來源不一定僅僅來源于組織/細胞或血清，已有科研工作者證明機體的血漿、唾液、尿液等都可用于篩選自身抗體[16]。②在樣品處理階段：a樣品進行標記，增加實驗結果的精確性，比如同位素標記、熒光標記[17-19]等。b樣品使用免疫法去除無關及豐度高的雜蛋白，從而提高蛋白分離效果，尤其是低豐度蛋白的分離效果。③試驗階段：樣品可以不斷免疫剝離實驗組與對照組的相同抗原，最后進行雙向電泳分析差異性；樣品或處理過的樣本也可以直接進行酶消化質譜鑒定。④實驗結果驗證階段：比如Western Blot、免疫組織化學方法及ELISA等。

例如，陳炯[20]等人聯合熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)與質譜分析，鑒定出蛋白質補體C3可能是胰腺癌早期潛在的血清特異性生物標記物，并應用Western Blot的方法驗證了這一結論。

又如，Marie Grandjean[19]等人在血清蛋白質組學分析方法的基礎上，設計出一種新的方案—順序免疫剝離—2D-DIGE方法。 他們通過研究NMRI鼠結直腸癌生物標記物，驗證了腫瘤細胞在缺氧條件下的免疫原蛋白，同時分析比較了血清蛋白質組學方法與順序免疫剝離—2D-DIGE方法。通過兩種分析方法的比較，發現在某些方面順序免疫剝離—2D-DIGE方法優于血清蛋白質組學分析方法，比如在非變形條件下發生抗原抗體反應，減少抗原多樣性以及有利于低豐度蛋白的富集等優點。為以后腫瘤生物標記物的研究提供了新的研究方案。

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