β—catenin蛋白敲除對肺成纖維細胞活性影響的實驗研究

張亞娟++++++田新瑞++++++常+++琴++++++王崇剛++++++董艷婷

[摘要] 目的 探討β-catenin蛋白敲除對TGF-β1誘導的肺成纖維細胞（CCC-REPF-1）活性的影響及其機制。方法 體外培養大鼠肺成纖維細胞（CCC-REPF-1），應用CCK-8法、Western blot、 RT-PCR技術檢測細胞增殖、活性及功能表達，進行統計學檢驗。 結果 TGF-β1刺激組、 pcDNA3轉染組CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn 蛋白表達量、α-SMA 、colⅠ、colⅢmRNA表達量明顯高于正常細胞組，而E-cadherin蛋白表達量明顯低于正常細胞組；F-TrCP-Ecad轉染組上述值明顯低于TGF-β1刺激組（P<0.01），E-cadherin蛋白表達量高于TGF-β1刺激組 （P<0.01）；TGF-β1刺激組、 pcDNA3轉染組比較無明顯差異。 結論 TGF-β1是促進肺成纖維細胞增殖、活化的重要細胞因子，β-catenin途徑是TGF-β1 發揮作用的重要信號通路，β-catenin蛋白敲除通過阻斷該信號途徑，阻止肺纖維化進程。

[關鍵詞] β-catenin；TGF-β1；肺成纖維細胞；肺纖維化

[中圖分類號] R563.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）21-0001-04

肺纖維化是呼吸系統疾病發展至晚期的共同病理改變，造成肺功能不可逆的損傷，嚴重危害人類健康[1]。目前研究認為，肺纖維化的基本病理過程包括早期彌漫性肺泡炎及后期大量間質細胞增生，發生基質膠原的進行性積聚以致逐漸取代正常的肺組織結構，嚴重影響肺的通氣和換氣功能[2-3]。在增生的細胞中，除肺泡上皮細胞和成肌細胞等外，成纖維細胞的增殖及活化并分泌基質膠原是纖維化形成的重要機制[4]。TGF-β1被認為是誘導肺成纖維細胞活化的最重要的細胞因子[5]，其作用的發揮與β-catenin途徑高度相關[6]。本研究通過觀察β-catenin蛋白敲除對TGF-β1誘導的肺成纖維細胞的增殖及活性的影響，探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細胞機制，為肺纖維化的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及物品

大鼠肺成纖維細胞（CCC-REPF-1），pcDNA3.0載體（Invitrogen），F-TrCP-Ecad載體（鄭國平教授惠贈），Lipofectamine2000（Invitrogen），TGF-β1（PeproTech），抗E-cadherin，抗α -SMA，抗Fn（ SantaCruz），FITC標志的羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司），胎牛血清（中國杭州四季青），高糖DMEM培養基（GIBCO），TRIzol總RNA提取試劑（武漢博士德生物工程有限公司），逆轉錄試劑盒（Promega），實時熒光定量試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），α-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）。

1.2 肺成纖維細胞培養、傳代及分組

在體外培養的大鼠肺成纖維細胞（CCC-REPF-1），用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基培養于5%的CO2，37℃人工培養箱中，細胞呈貼壁生長，進行傳代培養。細胞分組，分為正常細胞組（A組）、TGF-β1刺激組（B組）、pcDNA3轉染組（C組）、F-TrCP-Ecad轉染組（D組）。

1.3 pcDNA3及F-TrCP-Ecad轉染CCC-REPF-1細胞

提取及純化重組質粒DNA，測DNA 濃度備用。取對數期細胞消化，調整細胞數為2×105 cells/L，接種12孔板中，觀察細胞生長至80%～90%時，棄培液，換無血清無雙抗培養基800 μL，準備轉染。100 μL無雙抗、胎牛血清的培養基中加入4 ng 質粒，混合后置5 min，共6個EP管，3管為質粒pcDNA3，3管為質粒F-TrCP-Ecad，100 μL無雙抗、胎牛血清的培養基中加入 4 μL Lipofectamine2000混合后置 5 min，6個EP管，將上述復合物混合后置20 min，棄12孔板6孔的培養基，用無雙抗、胎牛血清的培養基清洗2次，加無雙抗、胎牛血清的培養基800 μL，將上述復合物分別加入 6個孔，前后晃置4～6 h換正常培養基。轉染6 h換新鮮培養基，各組分別加入TGF-β1（5 ng/mL），作用48 h。

1.4 CCK-8法檢測肺成纖維細胞增殖

將各組細胞調整細胞濃度至5000個/100 μL， 以每孔100 μL接種于96孔板，每組復設8孔，每板每孔加入CCK-8 10 μL，5%CO2孵育箱內繼續孵育1 h，分光光度計下測定450 nm波長處OD值。

1.5 Western 印跡檢測細胞中E-cadherin、α-SMA、Fn的表達

取細胞用PBS洗滌后轉移到EP管，離心后棄上清，將收集到的細胞加細胞裂解液裂解1 h后，離心30 min，取上清，BCA蛋白質定量法測定蛋白濃度，取等量蛋白30 μL行SDS-PVDF凝膠電泳，轉膜至PVDF膜，條件4 ℃ 2～5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h。在4 ℃下小鼠抗大鼠E鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白單克隆抗體（稀釋為1∶200）與膜接觸孵育過夜，用洗膜緩沖液（TBST）在脫色搖床下洗膜5 min×5次，加羊抗小鼠IgG，室溫下孵育2 h后，TBST洗膜，加入ECL在室溫下反應5 min后成像，Taiphone掃描結果，采用Gene Snap/Gene Tool軟件分析以GAPDH蛋白為內參定量分析E鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白條帶相對灰度值。

1.6 總RNA 抽提及實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（Real-timePCR）endprint

各組細胞每孔加入500 μL TRIzol Reagent，按試劑盒說明提取總RNA及行RT-PCR檢測α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表達，GAPDH為內參。

GAPDH引物序列：上游引物5ˊ- GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT -3ˊ下游引物5ˊ- CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT -3，α -SMA上游引物5ˊ- AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ，colⅠ：上游引物 5ˊ- GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGACCCTTAGGCCATTGTGA -3ˊcol Ⅲ：上游引物5ˊ- TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA -3ˊ下游引物5ˊ- GACAGATCCCGAGTTCGCAGA -3ˊ。PCR 反應體系條件： 95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s。40個循環。由隨機附帶軟件計算出Ct值和拷貝數。

1.7 統計學方法

計量資料采用均數±標準差表示，數據處理采用SPSS 19.0軟件進行t檢驗或方差分析，P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 肺成纖維細胞光鏡下觀察

成纖維細胞呈梭型，有較長的突起，胞核呈卵圓形，位于細胞中央，成放射狀和柵欄狀排列。TGF-β1刺激后，細胞體積明顯增大，胞突消失，細胞數量明顯增多，細胞間隙變小。F-TrCP-Ecad轉染組大部分細胞呈梭型，有較長的突起，細胞間有明顯間隙。見圖1。

A 正常細胞（倒置相差顯微鏡×200）

B TGF-β1 刺激組（倒置相差顯微鏡×200）

C pcDNA3轉染組（倒置相差顯微鏡×200）

D F-TrCP-Ecad轉染組（倒置相差顯微鏡×200）

圖1 肺成纖維細胞光鏡下觀察（×200）

2.2 CCK-8法觀察各組肺成纖維細胞增殖

與正常組比較， TGF-β1刺激組、pcDNA3轉染組其OD值明顯增高，但兩組比較，無統計學差異；F-TrCP-Ecad轉染組OD值較TGF-β1刺激組明顯減低（P<0.01），與正常組比較無統計學差異。見表1。

表1 CCK-8法測量各組大鼠肺成纖維細胞增殖OD值（x±s，n=8）

注：與正常組相比，aP<0.01；與F-TrCP-Ecad轉染組相比，bP<0.01；與TGF-β1 刺激組相比，cP<0.01；與pcDNA3轉染組比較，dP<0.01

2.3 Western印跡法檢測各組細胞中α-SMA、Fn、E-cadherin的表達

與正常組比較， TGF-β1刺激組、pcDNA3轉染組其α -SMA、Fn 蛋白表達顯著升高， E-cadherin表達顯著降低（P<0.01），而兩組比較無統計學差異；F-TrCP-Ecad轉染組較TGF-β1刺激組α -SMA、Fn 蛋白表達顯著降低，E-cadherin表達顯著升高（P<0.01），與正常組比較無統計學差異。見表2。

表2 各組大鼠肺組織中α-SMA、Fn 、E-cadherin蛋白表達（x±s，n=8）

注：與正常組相比，aP<0.01；與F-TrCP-Ecad轉染組相比，bP<0.01；與TGF-β1 刺激組相比，cP<0.01；與pcDNA3轉染組比較，dP<0.01

2.4 熒光實時定量RT-PCR檢測α-SMA、colⅠ、colⅢ表達

與正常組比較， TGF-β1刺激組、pcDNA3轉染組β-catenin途徑α -SMA，colⅠ，colⅢmRNA表達增高（P<0.01），而兩組比較無統計學差異，F-TrCP-Ecad轉染組較TGF-β1刺激組α-SMA、colⅠ、colⅢ表達降低（P<0.01），與正常組比較無統計學差異。見表3。

表3 各組細胞α-SMA 、colⅠ、col Ⅲ mRNA相對表達量比較

（x±s，n=8）

注：與正常組相比，aP<0.01；與F-TrCP-Ecad轉染組相比，bP<0.01；與TGF-β1 刺激組相比，cP<0.01；與pcDNA3轉染組比較，dP<0.01

3 討論

肺成纖維細胞增殖與活性增強是肺纖維化發生的重要的致病過程，對其機制的研究并尋找新的治療靶點是目前研究的焦點[7]。肺纖維化過程中在TGF-β1刺激下[8]使肺成纖維細胞不斷地增殖和轉型為肌成纖維細胞（myofibroblast，MB）。MB是一種特殊階段的FB，能夠大量分泌ECM，分泌能力是FB 的4～5倍，大量表達α-SMA、Fn、I、III型膠原，加速纖維化進程。

TGF-β1是誘導肺成纖維細胞活化發生的最重要的生長因子[9]，TGF-β1發揮作用的途徑包括Smad、β-catenin和非Smad通路，其β-catenin途徑與疾病及纖維化形成的病理過程高度相關[8]。Vuga，et al[10]發現WNT5A基因途徑在IPF的肺成纖維細胞較正常肺成纖維細胞有顯著地調節意義，通過非經典的WNT/β-catenin途徑[11-13]WNT5A激活顯著地誘導肺成纖維細胞增殖同時抑制細胞凋亡。Chilosi等[14]報道了在特發性肺纖維化（IPF）患者受損支氣管基底細胞和損傷部位肺成纖維細胞中可見β-catenin向細胞核內轉移、積聚，提示β-catenin與肺纖維化及肺成纖維細胞活性的相關性，因此我們設想通過抑制β-catenin功能可能對肺纖維化發揮治療作用。

F-TrCP-Ecad質粒是Cong[15]等設計的β-catenin靶向降解質粒，只降解細胞質中的β-catenin蛋白，而不破壞細胞膜上的β-catenin蛋白，從而減少其向細胞核內的轉移，降低其轉錄活性。本研究采用該載體轉染大鼠成纖維細胞，觀察阻斷β-catenin途徑對肺成纖維細胞增殖及活性的影響。結果顯示：TGF-β1刺激48 h后，成纖維細胞體積明顯增大，胞突消失，細胞數量明顯增多，細胞間隙變小，F-TrCP-Ecad轉染組大部分細胞呈梭型，有較長的突起，細胞間有明顯間隙。CCK-8法檢測F-TrCP-Ecad轉染組肺成纖維細胞增殖較TGF-β1刺激組明顯降低。F-TrCP-Ecad轉染組肺成纖維細胞間質細胞標志物α -SMA、Fn蛋白表達量明顯低于TGF-β1刺激組，E-cadherin表達量較TGF-β1刺激組增高。F-TrCP-Ecad轉染組大鼠肺成纖維細胞β-catenin途徑轉錄產物α-SMA、colⅠ、colⅢ表達明顯降低，證實β-catenin蛋白敲除通過降解細胞質中的β-catenin蛋白，減少其向細胞核內的轉移抑制TGF-β1 誘導的肺成纖維細胞增殖、活性增強，抑制纖維化進程。endprint

綜上所述，TGF-β1是促進肺成纖維細胞增殖、活化的重要細胞因子，β-catenin途徑是TGF-β1 發揮作用的重要信號通路，β-catenin蛋白敲除載體（F-TrCP-Ecad質粒）通過阻斷該信號途徑，阻斷成纖維細胞轉化為其活性形式肌成纖維細胞，同時抑制成纖維細胞釋放胞外基質，阻斷纖維化進程，從而能為肺纖維化疾病治療提供新的思路及實驗依據。

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（收稿日期：2014-04-01）endprint