半夏愈傷組織誘導(dǎo)與分化最適培養(yǎng)基篩選

林秋月等

摘要：以半夏[Pinellia ternata （Thunb.）Breit.]葉片為試驗材料，研究不同培養(yǎng)基配方對半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化、愈傷組織增殖及分化的影響。結(jié)果表明，適合半夏葉片誘導(dǎo)脫分化的培養(yǎng)基為MS+0.8 mg/L 6-BA+1.8 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D；適合愈傷組織增殖的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D；適合分化生長的培養(yǎng)基為MS+0.8 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。

關(guān)鍵詞：半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit.]；組織培養(yǎng)；激素；愈傷組織

中圖分類號：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3183-04

Screening of Optimal Medium for Callus Inducing and Redifferentiation of

Pinellia ternata （Thunb.）Breit.

LIN Qiu-yue，ZENG Wan-yong，LI Tian-pei，LI Rui，CHEN Ping，LI Jin-hua

（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract： Leaves of Pinellia ternata（Thunb.）Breit. were used to investigate the effects of several mediums on the induced dedifferentiation ratio， callus proliferation ratio and redifferentiation ratio of leaves of Pinellia ternata （Thunb. ）Breit.. The results showed that the optimal medium for leaves dedifferentiation， callus proliferration and redifferentiation were MS+0.8 mg/L 6-BA+1.8 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D，MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D and MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D，respectively.

Key words： Pinellia ternata （Thunb.）Breit.； tissue culture； hormone； callus

半夏[Pinellia ternata （Thunb.）Breit.]別名旱半夏、三葉半夏、半月蓮， 為天南星科半夏屬多年生草本植物，以塊莖入藥，能燥濕化痰、降逆止咳，生用消癤腫，主治咳嗽痰多、惡心嘔吐等[1]。半夏含半夏生物堿、半夏蛋白、β-谷甾醇、刺激性成分草酸鈣、多種氨基酸等，還含有揮發(fā)油、游離有機(jī)酸、3， 4-二羥基苯甲醛、淀粉、膽堿和葡萄糖苷等多種成分。半夏生物堿有鎮(zhèn)痛、抗血栓形成等作用；半夏蛋白、β-谷甾醇有抗腫瘤作用。因此，備受國內(nèi)外的關(guān)注，需求量較大[2]。由于連年采挖，半夏野生資源日趨枯竭，人工栽培種源缺乏、繁殖系數(shù)低，且病蟲害感染嚴(yán)重，致使藥材質(zhì)量不穩(wěn)定。而半夏組培苗具有生長速度快、繁殖系數(shù)高、不帶病毒等特點， 所以利用組織培養(yǎng)再生苗或者用于提取有效成分已成為發(fā)展的趨勢。

有學(xué)者對半夏愈傷組織誘導(dǎo)和分化進(jìn)行了研究[3-6]。在前期對其他中藥材組培研究的基礎(chǔ)上[7，8]，本研究選用半夏葉片為外植體，比較了不同培養(yǎng)基成分對愈傷組織培養(yǎng)的影響，探索愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化等時期的最適激素配比，以獲得半夏細(xì)胞工程研究中各環(huán)節(jié)的最佳條件，旨在為實現(xiàn)半夏種苗和有效成分的工廠化生產(chǎn)以及開展人工種子研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自恩施州野三關(guān)野生半夏種球。

1.2 方法

1.2.1 半夏外植體的獲得 將野外采集的半夏種球種植在花盆中，待葉片出土展開后取樣，經(jīng)滅菌作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，肌醇0.1 g/L，酸水解酪蛋白（CH）0.3 g/L，pH 5.8，附加不同激素配比（表1）。121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.3 半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化 以MS為基本培養(yǎng)基，按表1分別添加不同濃度的6-BA、NAA、2，4-D，每瓶分裝培養(yǎng)基約40 mL。將健康無菌的葉片接種于培養(yǎng)基中，每瓶接種5片葉，每組接種10瓶。接種好的樣品置于培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃。每5 d統(tǒng)計葉片誘導(dǎo)率（葉片脫分化面積占整片接種材料的比例），采用t檢驗分析不同激素配比對半夏脫分化的差異顯著性水平。

1.2.4 半夏愈傷組織的增殖 將生長狀態(tài)相同的愈傷組織轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中（B0-B7），在黑暗條件下25 ℃培養(yǎng)，每5 d觀察并統(tǒng)計愈傷組織的增殖情況（愈傷組織的直徑），分析不同激素配比下對愈傷組織增殖的影響。

1.2.5 半夏愈傷組織的分化 將生長狀態(tài)相同的增殖愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基（B0-B7）中。在黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)5 d后光照下培養(yǎng)，光照為16 h/d，光照度為2 000～2 500 lx。每5 d觀察并統(tǒng)計愈傷組織的出芽數(shù)（以葉柄高于5 mm計為1苗），并分析不同激素配比對誘導(dǎo)分化的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化

從圖1可以看出，在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，除對照組外，均能誘導(dǎo)半夏葉片的脫分化，但愈傷組織的誘導(dǎo)率差異較大。接種后5 d觀察，已經(jīng)有愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織產(chǎn)生速度最快是B4培養(yǎng)基，在15 d時已經(jīng)超過80%。在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織顏色嫩黃，質(zhì)量均較好（圖2）。經(jīng)過顯著性水平分析，15 d時B4培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率與對照達(dá)到顯著差異水平，因此，B4培養(yǎng)基最適合半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化。

2.2 半夏愈傷組織的增殖

從圖3可以看出，在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，對半夏愈傷組織的增殖存在明顯影響。經(jīng)過20 d的觀察統(tǒng)計，B2和B4培養(yǎng)基上半夏愈傷組織的增殖速度較快，B3有分化情況出現(xiàn)（圖4）。經(jīng)過顯著性分析，20 d時B2培養(yǎng)基上半夏愈傷組織直徑與對照相比差異較大，但處理之間未達(dá)到顯著水平。因此，B2培養(yǎng)基較適合半夏愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

2.3 半夏愈傷組織的分化

在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，對半夏愈傷組織的分化影響較大，其中，B1、B2、B3、B4培養(yǎng)基接種5～15 d，半夏愈傷組織均有出芽，B3培養(yǎng)基接種15 d后愈傷組織出芽數(shù)最多，B5、B6、B7培養(yǎng)基上的分化芽很少（圖5）。經(jīng)過顯著性差異分析，15 d 時B3培養(yǎng)基上的出芽數(shù)與對照相比差異達(dá)到顯著水平，因此，B3培養(yǎng)基最適合半夏愈傷組織的分化。

3 結(jié)論與討論

半夏是我國重要的大宗藥材，研究發(fā)現(xiàn)除了傳統(tǒng)的藥用功效外，其生物堿還具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的功能，其多糖具有清除羥自由基的功能[9]，其蛋白質(zhì)具有抗腫瘤、抗生育、抗蚜蟲的功能。目前，半夏的市場需求量越來越大，而生產(chǎn)上由于種苗供應(yīng)不足，供需矛盾越來越突出，導(dǎo)致市場價格持續(xù)攀升。近年來，對半夏種苗快速繁殖技術(shù)的研究越來越多，人工種子研究也有報道[10]。半夏組織培養(yǎng)研究不僅有助于種苗生產(chǎn)，還有助于利用細(xì)胞工程工廠化生產(chǎn)藥用成分，解決在半夏田間生長慢的問題。

本試驗結(jié)果表明，中等濃度的激素水平有利半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)，較高濃度的激素反而抑制其葉片脫分化。2，4-D對半夏愈傷組織增殖有促進(jìn)作用。葉片前期脫分化水平影響到后期愈傷組織的增殖，相對而言，脫分化水平越高，增殖效果越好。但是不同激素水平對愈傷組織增殖的效率存在差異。在暗培養(yǎng)中，同時觀察到B1、B3培養(yǎng)基上最先出現(xiàn)根的生長，B3生根較多。

綜合分析表明，適合半夏一次性成苗的培養(yǎng)配方為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。此配方得到的半夏愈傷組織叢芽較多，長勢較壯且長有根，且均能分化成苗。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志.第13卷第2冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，1979.

[2] 毛子成，彭正松.半夏研究進(jìn)展[J].江西科學(xué)，2002，20（1）：42-46.

[3] 程霞英，楊宗岐.半夏愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（9）：4-6.

[4] 彭向前，張文會.半夏的分生組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，32（2）：46-49.

[5] 楊玉珍，王西雨，胡如善，等.半夏的組織培養(yǎng)與快繁試驗[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：10-11.

[6] 馬宗新.半夏的組織培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2009，15（8）：40，232.

[7] LI W， XIE Y M， LUO C P， et al. Study on rapid propagation medium of atractylodes lances by orthogonal design[J].Agricultural Science & Technology，2012，13（1）：49-52.

[8] 曾萬勇，李金華，王 智，等.鐵皮石斛無菌萌發(fā)及小苗快繁培養(yǎng)條件研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2012，31（3）：10-12，47.

[9] 郭輝娟，魏定國.半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其清除自由基能力研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19341-19342，19345.

[10] 張?zhí)K鋒.半夏人工種子的研究[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），1998，11（3）：281-282.

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化

從圖1可以看出，在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，除對照組外，均能誘導(dǎo)半夏葉片的脫分化，但愈傷組織的誘導(dǎo)率差異較大。接種后5 d觀察，已經(jīng)有愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織產(chǎn)生速度最快是B4培養(yǎng)基，在15 d時已經(jīng)超過80%。在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織顏色嫩黃，質(zhì)量均較好（圖2）。經(jīng)過顯著性水平分析，15 d時B4培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率與對照達(dá)到顯著差異水平，因此，B4培養(yǎng)基最適合半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化。

2.2 半夏愈傷組織的增殖

從圖3可以看出，在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，對半夏愈傷組織的增殖存在明顯影響。經(jīng)過20 d的觀察統(tǒng)計，B2和B4培養(yǎng)基上半夏愈傷組織的增殖速度較快，B3有分化情況出現(xiàn)（圖4）。經(jīng)過顯著性分析，20 d時B2培養(yǎng)基上半夏愈傷組織直徑與對照相比差異較大，但處理之間未達(dá)到顯著水平。因此，B2培養(yǎng)基較適合半夏愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

2.3 半夏愈傷組織的分化

在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，對半夏愈傷組織的分化影響較大，其中，B1、B2、B3、B4培養(yǎng)基接種5～15 d，半夏愈傷組織均有出芽，B3培養(yǎng)基接種15 d后愈傷組織出芽數(shù)最多，B5、B6、B7培養(yǎng)基上的分化芽很少（圖5）。經(jīng)過顯著性差異分析，15 d 時B3培養(yǎng)基上的出芽數(shù)與對照相比差異達(dá)到顯著水平，因此，B3培養(yǎng)基最適合半夏愈傷組織的分化。

3 結(jié)論與討論

半夏是我國重要的大宗藥材，研究發(fā)現(xiàn)除了傳統(tǒng)的藥用功效外，其生物堿還具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的功能，其多糖具有清除羥自由基的功能[9]，其蛋白質(zhì)具有抗腫瘤、抗生育、抗蚜蟲的功能。目前，半夏的市場需求量越來越大，而生產(chǎn)上由于種苗供應(yīng)不足，供需矛盾越來越突出，導(dǎo)致市場價格持續(xù)攀升。近年來，對半夏種苗快速繁殖技術(shù)的研究越來越多，人工種子研究也有報道[10]。半夏組織培養(yǎng)研究不僅有助于種苗生產(chǎn)，還有助于利用細(xì)胞工程工廠化生產(chǎn)藥用成分，解決在半夏田間生長慢的問題。

本試驗結(jié)果表明，中等濃度的激素水平有利半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)，較高濃度的激素反而抑制其葉片脫分化。2，4-D對半夏愈傷組織增殖有促進(jìn)作用。葉片前期脫分化水平影響到后期愈傷組織的增殖，相對而言，脫分化水平越高，增殖效果越好。但是不同激素水平對愈傷組織增殖的效率存在差異。在暗培養(yǎng)中，同時觀察到B1、B3培養(yǎng)基上最先出現(xiàn)根的生長，B3生根較多。

綜合分析表明，適合半夏一次性成苗的培養(yǎng)配方為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。此配方得到的半夏愈傷組織叢芽較多，長勢較壯且長有根，且均能分化成苗。

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[9] 郭輝娟，魏定國.半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其清除自由基能力研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19341-19342，19345.

[10] 張?zhí)K鋒.半夏人工種子的研究[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），1998，11（3）：281-282.

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化

從圖1可以看出，在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，除對照組外，均能誘導(dǎo)半夏葉片的脫分化，但愈傷組織的誘導(dǎo)率差異較大。接種后5 d觀察，已經(jīng)有愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織產(chǎn)生速度最快是B4培養(yǎng)基，在15 d時已經(jīng)超過80%。在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織顏色嫩黃，質(zhì)量均較好（圖2）。經(jīng)過顯著性水平分析，15 d時B4培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率與對照達(dá)到顯著差異水平，因此，B4培養(yǎng)基最適合半夏葉片的誘導(dǎo)脫分化。

2.2 半夏愈傷組織的增殖

從圖3可以看出，在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，對半夏愈傷組織的增殖存在明顯影響。經(jīng)過20 d的觀察統(tǒng)計，B2和B4培養(yǎng)基上半夏愈傷組織的增殖速度較快，B3有分化情況出現(xiàn)（圖4）。經(jīng)過顯著性分析，20 d時B2培養(yǎng)基上半夏愈傷組織直徑與對照相比差異較大，但處理之間未達(dá)到顯著水平。因此，B2培養(yǎng)基較適合半夏愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

2.3 半夏愈傷組織的分化

在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的激素，對半夏愈傷組織的分化影響較大，其中，B1、B2、B3、B4培養(yǎng)基接種5～15 d，半夏愈傷組織均有出芽，B3培養(yǎng)基接種15 d后愈傷組織出芽數(shù)最多，B5、B6、B7培養(yǎng)基上的分化芽很少（圖5）。經(jīng)過顯著性差異分析，15 d 時B3培養(yǎng)基上的出芽數(shù)與對照相比差異達(dá)到顯著水平，因此，B3培養(yǎng)基最適合半夏愈傷組織的分化。

3 結(jié)論與討論

半夏是我國重要的大宗藥材，研究發(fā)現(xiàn)除了傳統(tǒng)的藥用功效外，其生物堿還具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的功能，其多糖具有清除羥自由基的功能[9]，其蛋白質(zhì)具有抗腫瘤、抗生育、抗蚜蟲的功能。目前，半夏的市場需求量越來越大，而生產(chǎn)上由于種苗供應(yīng)不足，供需矛盾越來越突出，導(dǎo)致市場價格持續(xù)攀升。近年來，對半夏種苗快速繁殖技術(shù)的研究越來越多，人工種子研究也有報道[10]。半夏組織培養(yǎng)研究不僅有助于種苗生產(chǎn)，還有助于利用細(xì)胞工程工廠化生產(chǎn)藥用成分，解決在半夏田間生長慢的問題。

本試驗結(jié)果表明，中等濃度的激素水平有利半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)，較高濃度的激素反而抑制其葉片脫分化。2，4-D對半夏愈傷組織增殖有促進(jìn)作用。葉片前期脫分化水平影響到后期愈傷組織的增殖，相對而言，脫分化水平越高，增殖效果越好。但是不同激素水平對愈傷組織增殖的效率存在差異。在暗培養(yǎng)中，同時觀察到B1、B3培養(yǎng)基上最先出現(xiàn)根的生長，B3生根較多。

綜合分析表明，適合半夏一次性成苗的培養(yǎng)配方為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D。此配方得到的半夏愈傷組織叢芽較多，長勢較壯且長有根，且均能分化成苗。

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