L-鳥氨酸脫羧酶抑制劑篩選模型的建立

郝秀菊 劉志輝 欒文姬 王鋒 蘇麗娜 陳俊峰

·論著·

L-鳥氨酸脫羧酶抑制劑篩選模型的建立

郝秀菊 劉志輝 欒文姬 王鋒 蘇麗娜 陳俊峰

目的基于酶促反應(yīng)法，利用HPLC測(cè)定腐胺含量，評(píng)價(jià)待篩選藥物對(duì)PC-3M細(xì)胞中L-鳥氨酸脫羧酶(L-ODC)活性的影響,建立鳥氨酸脫羧酶抑制劑的篩選模型。方法將與藥物反應(yīng)后的細(xì)胞處理樣本，以TSKge lODS- 80TM凝膠色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)為分析柱，在甲醇-水(8∶2)保持3 min，從4 min到14 min，甲醇比率由80%梯度增至100%梯度洗脫,流速為0.8 ml/min,激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm，柱溫為50℃，進(jìn)樣量10 μl。按內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果ODC特異性抑制劑二氟甲基鳥氨酸(DFMO)對(duì)ODC活性的抑制率為(59.3±5.4)%，雷帕霉素對(duì)ODC活性的抑制率為(29.8±6.4)%，姜黃素對(duì)ODC活性的抑制率為(26.1±6.6)%。結(jié)論本模型通過測(cè)定藥物對(duì)ODC細(xì)胞內(nèi)鳥氨酸脫羧酶的作用，利用HPLC分離法測(cè)定在藥物抑制影響下的鳥氨酸脫羧酶的活性，這一模型有望成為篩選ODC抑制劑的快速方便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

L-鳥氨酸脫羧酶；L-鳥氨酸脫羧酶抑制劑；篩選模型

鳥氨酸脫羧酶(ODC)在人體內(nèi)普遍存在，參與到鳥氨酸的代謝，其發(fā)揮作用的輔酶是磷酸吡哆醛，其僅占到人體細(xì)胞總的可溶性蛋白質(zhì)的0.016%[1]，但是起到的作用十分重要。在人體多胺生物合成過程中，利用ODC催化鳥氨酸轉(zhuǎn)化成腐胺[2]，是一種限速酶。而精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT) 是參與多胺分解代謝的關(guān)鍵酶,其主要作用是催化精胺和精脒轉(zhuǎn)化為腐胺[3]。有研究表明，在腫瘤組織中ODC的活性顯著高于正常組織，因此鳥氨酸脫羧酶成為現(xiàn)在的較為熱點(diǎn)的抗癌藥物靶標(biāo)[4]。然而，目前雖然作為抗癌藥物的ODC抑制劑是抗癌藥物研究的熱點(diǎn)之一，但是篩選抗癌藥物模型較為單一，主要是使用傳統(tǒng)的方法測(cè)定并評(píng)價(jià)，測(cè)定的結(jié)果誤差較大且不夠準(zhǔn)確，而本次試驗(yàn)建立的ODC抑制劑篩選模型的測(cè)定方法，主要采用衍生化的高效液相色譜分析(HPLC)的方法測(cè)定ODC酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物。本研究方法是測(cè)定ODC催化L-鳥氨酸脫羧基反應(yīng)，在一定的時(shí)間內(nèi)生成的產(chǎn)物量，由于其產(chǎn)物生成的量與ODC的活性成正比，因此ODC抑制劑的作用效果可以通過產(chǎn)物生成的減少量來反應(yīng)。在ODC與L-鳥氨酸反應(yīng)過程中，其產(chǎn)物能夠與特定的物質(zhì)反應(yīng)，反應(yīng)后的衍生物經(jīng)過高效液相色譜儀(HPLC)分析后，經(jīng)過的高靈敏度的分離得到產(chǎn)物腐胺，由于其衍生物具有熒光信號(hào)，因此僅需要檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就能測(cè)定產(chǎn)物腐胺的生成量，以此反映ODC的催化活性[5]，以及不同目標(biāo)藥物對(duì)該酶催化活性的抑制作用，進(jìn)而進(jìn)行ODC抑制劑的篩選。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 細(xì)胞高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco 公司)，RNase A、磺酰羅丹明B (SRB)、鳥氨酸(Ornithine)、二氟甲基鳥氨酸(DFMO)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、5-磷酸吡哆醛、(Sigma 公司)，美國(guó)戴安SUMM IT系列高效液相色譜儀(包括ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器,P680高壓泵,RF-2000熒光檢測(cè)器，TCC-100柱溫箱);旋渦混合震蕩器；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);TGL-16G高速冷凍離心機(jī)。

1.2 細(xì)胞株 本次試驗(yàn)所用的細(xì)胞株為人前列腺癌細(xì)胞(PC-3M細(xì)胞)，由本院細(xì)胞庫(kù)提供。其主要的培養(yǎng)液為RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中:加入10%的四季青小牛血清，加入青霉素和鏈霉素，其終濃度為100 mg/L。培養(yǎng)條件為37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 腐胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制：利用精密電子天平準(zhǔn)確稱取腐胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,加入到10 ml的容量瓶中,然后加入0.1 mmol/ml鹽酸溶液，加到容量瓶的刻度線,震蕩搖勻至澄清即可，其濃度為1.0 mg/ml。

1.3.2 藥物篩選細(xì)胞樣本的制備：選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3M 細(xì)胞配制成濃度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。吸取5 ml接種到直徑為6 cm的塑料小平皿中，37℃培養(yǎng)24 h。然后向平皿中加入不同濃度的待篩選藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h[其中以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對(duì)照]。將培養(yǎng)后的細(xì)胞收集，利用磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次，用作酶提取液(其中PBS 50 mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.1 mmol/L，二硫蘇糖醇(DTT) 5 mmol/L，5-磷酸哆醛0.2 mmol/L),pH值7.2；底物溶液成分為磷酸緩沖液50 mmol/L，pH值7.2，EDTA 0.1 mmol/L， DTT 5 mmol/L，5-磷酸吡哆醛0.2 mmol/L，鳥氨酸5 mmol/L,400 μl懸浮細(xì)胞，凍融法破碎細(xì)胞(即液氮-37℃反復(fù)凍融3～4次)，離心15 000×g，10 min，4℃，收集上清溶液即為待測(cè)定組酶溶液。

1.3.3 色譜條件的確定：色譜柱: TSKgelODS-80TM 凝膠色譜柱(150 mm×46 mm,5 m)；流動(dòng)相: 甲醇與水的濃度為80%。80%甲醇流動(dòng)相保持3 min,從第4分鐘開始逐漸提高甲醇的濃度，到第14 分鐘時(shí)，甲醇的濃度增高至100%。熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)為340 nm,熒光的發(fā)射光波長(zhǎng)為515 nm。溫度控制為50℃；洗脫液的流速為0.8 ml/min；樣本的進(jìn)樣量為10 μl。

1.3.4 酶活力的測(cè)定：用加樣器取1 ml的洗脫上清液,加入到5 ml的離心管中,再加入200 μl濃度為3 mmol/L的鳥氨酸鹽酸鹽,振蕩混勻1 min,之后，將5 ml的離心管置于的恒溫37℃水浴中反應(yīng)60 min,用加樣器加入100 μl濃度為20% 三氯乙酸溶液來終止反應(yīng)。然后用加樣器向反應(yīng)液中加入50 μl濃度為0.01 mg/ml的腐胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，300 μl的濃度為5 mg/ml的DNS-Cl丙酮溶液，150 μl的pH值調(diào)整為10的碳酸鹽緩沖溶液，震蕩混勻,提高恒溫水浴至70℃，在避光的條件下，反應(yīng)40 min。反應(yīng)完成后馬上用加樣器加入25 μl的脯氨酸，繼續(xù)反應(yīng)20 min。反應(yīng)完成后用400 μl的甲苯分成2次萃取,萃取物用氮?dú)獯蹈珊笕苡?00 μl甲醇中,使用微孔濾膜在無菌的條件下過濾后,取10 μl上樣。

1.3.5 回歸方程計(jì)算：利用加樣器吸取腐胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液50 μl，然后利用0.1 mmol/ml的鹽酸配制成系列腐胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1.134、5.67、11.344、22.688、45.376、68.064 mol/L)分別按照上述反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完成后,利用加樣器精密吸取10 μl對(duì)色譜儀進(jìn)行上樣,根據(jù)所得面積,計(jì)算回歸方程,所得方程為:Y=0.2622X-0.5353，r=0.9988。

1.3.6 精密度試驗(yàn)：利用上述配制的濃度為22.688 μmol/L腐胺標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。每次加樣10 μl，分10次加樣，每次加樣后進(jìn)行分析其峰圖面積和保持的時(shí)間長(zhǎng)度，RSD(n=10)記錄為0.15%和0.19%。

1.3.7 ODC酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

1.3.7.1 反應(yīng)時(shí)間與酶促反應(yīng)速率的關(guān)系：在酶促反應(yīng)的過程中,反應(yīng)速率隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)出一定關(guān)系。選經(jīng)“1.3.2” 項(xiàng)中洗脫后所的得到的上清液(未經(jīng)藥物作用的空白組),在37℃水浴條件下反應(yīng)10～50 min。發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)的0～40 min內(nèi),反應(yīng)速率與時(shí)間幾乎呈正比；40 min后的反應(yīng)速率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。見圖1。

圖1 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)速率的關(guān)系

1.3.7.2 不同藥物對(duì)對(duì)ODC反應(yīng)速率的影響：在本次試驗(yàn)的ODC反應(yīng)過程中，ODC的量也對(duì)其總的活性有影響，和試驗(yàn)進(jìn)程中的反應(yīng)速率之間有著直接相互關(guān)系。在控制ODC的量不變時(shí)，其反應(yīng)的酶活性對(duì)反應(yīng)的速率起決定性作用。將“1.3.2”項(xiàng)下不同藥物添加到反應(yīng)液中，反應(yīng)后取等量得細(xì)胞上清液(0～1 ml)，按照“1.3.4”項(xiàng)的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定ODC活性與反應(yīng)速率的相互關(guān)系，反應(yīng)速率隨著抑制率的加強(qiáng)而減小，呈現(xiàn)一種負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

1.3.7.3 底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響：在本次研究中,控制ODC的條件一定時(shí)，隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率也會(huì)出現(xiàn)明顯的變化，說明底物濃度與反應(yīng)速率存在相關(guān)性，屬于酶促反應(yīng)的典型特征。取反應(yīng)后的上清液1 ml，分別與200 μl不同濃度的鳥氨酸鹽進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)其變化范圍在0～3 mmol/L時(shí)，兩者的反應(yīng)速率表現(xiàn)出顯著的酶促反應(yīng)特征，表現(xiàn)為一條雙曲線的形式。就此特征表明兩者的反應(yīng)可以認(rèn)為是酶促反應(yīng)的形式。

1.3.7.4 利用動(dòng)力學(xué)方程測(cè)定米氏方程Km：ODC催化其底物L(fēng)-鳥氨酸脫羧生成腐胺,該反應(yīng)屬于酶促反應(yīng)，通過計(jì)算得出其米氏方程的Km值。

2 結(jié)果

2.1 不同ODC抑制劑對(duì)酶活性的影響 將已知的ODC的特異性抑制劑：二氟甲基鳥氨酸、雷帕霉素和姜黃素分別加到“1.3.4”項(xiàng)的反應(yīng)體系中按照其反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。同時(shí)以不加入ODC的特異性抑制劑的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。按照“1.3.5”項(xiàng)所確定的回歸方程Y=0.2622X-0.5353Y進(jìn)行計(jì)算，與空白對(duì)照進(jìn)行比較得出不同ODC特異性抑制劑對(duì)ODC的抑制率。不同ODC抑制劑對(duì)酶活性的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。見表1。

指標(biāo)空白二氟甲基鳥氨酸空白雷帕霉素空白姜黃素鳥氨酸脫羧酶活性0．91±0．050．37±0．050．94±0．070．66±0．060．91±0．070．65±0．06 P值<0．01<0．05<0．05

2.2 抑制率情況 ODC特異性抑制劑二氟甲基鳥氨酸對(duì)ODC活性的抑制率為(59.3±5.4)%，雷帕霉素對(duì)ODC活性的抑制率為(29.8±6.4)%，姜黃素對(duì)ODC活性的抑制率為(26.1±6.6)%。

3 討論

本次研究中在選用的細(xì)胞系的時(shí)候，第一我們考慮到自己實(shí)驗(yàn)室的保存的細(xì)胞株，第二通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)人前列腺細(xì)胞系是一種較好的細(xì)胞系，主要原因是ODC的表達(dá)較高[6，7]。所以本次研究的主要的測(cè)試細(xì)胞選為PC-3M。

DNS-Cl是一種應(yīng)用最廣的HPLC衍生試劑,它可與腐胺等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。它在多方面對(duì)衍生化反應(yīng)有著重要的影響。首先是濃度的影響，分別考察了DNS-Cl是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/ml時(shí)衍生試劑的量對(duì)衍生反應(yīng)產(chǎn)物量和色譜峰的影響。通過本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生反應(yīng)的DNS-Cl濃度控制在7 mg/ml時(shí)，通過高效液相色譜法檢測(cè)到的腐胺衍生物的圖峰面積的值是最大的。其次是pH值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響也是至關(guān)重要的，我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有在pH值為10的時(shí)候，所得到的圖峰面值最大，主要原因是DNS-Cl在酸性的環(huán)境下易水解,此研究表明，本次反應(yīng)的速率會(huì)受到反應(yīng)環(huán)境pH值的影響。溫度的選擇也是很重要，溫度的變化會(huì)影響酶活性，影響反應(yīng)的速率和反應(yīng)后的產(chǎn)物的生成量，此次研究表明，本次反應(yīng)的速率會(huì)收到反應(yīng)體系溫度的影響。此外，時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響反應(yīng)的進(jìn)行，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶促反應(yīng)的速率明顯受到影響。經(jīng)過本次試驗(yàn)的條件摸索，反應(yīng)的條件設(shè)定在 70℃，反應(yīng)時(shí)間保持40 min，是最合適的條件。

本研究中，我們也對(duì)體系進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇和水的比例保持在(8∶2)時(shí)候其效果最好，80%甲醇流動(dòng)相保持3 min后,從第4分鐘開始逐漸提高甲醇的濃度，到第14 分鐘時(shí)，甲醇的濃度增高至100%，分離度很好，峰形也很好。

本模型通過藥物對(duì)PC-3M細(xì)胞的作用，利用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，考察了在不同ODC抑制劑作用下的ODC的活性,并對(duì)其酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。使用高效液相色譜儀的凈化衍生的方法替代傳統(tǒng)的方法,提高了靈敏度和準(zhǔn)確度，此外，我們運(yùn)用動(dòng)力學(xué)方法的討論并完善了其檢測(cè)的條件,使之形成統(tǒng)一的用于檢測(cè)ODC活性的標(biāo)準(zhǔn),此外該方法的操作較為簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性較好，易于臨床的推廣。更重要的是，利用該模型篩選特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)小，選擇抑制能力高的抑制劑，可以進(jìn)一步開發(fā)成多種新型抗腫瘤藥物。因此這種方法對(duì)于腫瘤的治療有極高的應(yīng)用價(jià)值。

1 Ngo TT,Brillhart KL,Davis RH,et al.Spectrophotometric assay for ornithine decarboxylase.Anal Biochem,1987,160：290-293.

2 趙君庸.多胺免疫組織化學(xué)方法的建立及在肺癌研究中的應(yīng)用.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，1983,4:22.

3 Almrud JJ,Oliveira MA,Grishin NV,et al.Crystal structure of human ornithine decarboxylase at 2.1 A resolution:structural insights to antizyme binding.J Mol Biol,2000,295:7-16.

4 Luk GD.Ornithine decarboxylase as a biologic marker in familial colonic polyposis.N Emg J Med,1984,311:80.

5 沈希強(qiáng).多胺及其與癌癥的關(guān)系.國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè),1990,17:82.

6 Liu XX,Wang L,Lin Y,et al.Ornithine decarboxylase activity and its gene expression are increased in benign hyperplastic prostate.Prostate,2000，43：83-87.

7 Victor A,Levin Q,Jacob L,et al.Tissue-based assay for ornithinedecarboxylase to identify patients likely to respond to difluoromethyl ornithine.J Histochem Cytochem,2004,52:1467.

TheestablishmentofscreeningmodelofL-ornithinedecarboxylaseinhibitor

HAOXiuju*,LIUZhihui,LUANWenji,etal.

*DepartmentofICU,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo evaluate the effect of screening drugs on activity of L-ornithine decarboxylase (L-ODC) in PC-3M cells by means of HPLC,and to establish the screening model of L-ornithine decarboxylase inhibitor.MethodsA TSKge lODS- 80TM column (150mm×4.6mm,5μm) was used for chromatographic separations,in gradient conditions at 0.8ml/min,with the mobile phase composed by water-methanol.The initial mobile phase was composed by 80% methanol,20% water,maintained for 3min.Then during 4～14min,the composition was linear changed to 100% methanol,maintained for 3 min.The excitation wavelength was set at 340nm and emission wavelength was 515nm.The injection volume was 10μl.ResultsThe inhibition rate of difluoromethylornithine (DMFO) to the activity of L-ODC was(59.3±5.4)%,the inhibition rate of rapamycin to activity of L-ODC was (29.8±6.4)% and the inhibition rate of curcumin to the activity of L-ODC was (26.1±6.6)%.ConclusionThe model established by detecting the effect of L-ornithine decarboxylase in cells and detecting the activity of L-ornithine decarboxylase by means of HPLC may become a rapid,accurate,convenient detection method for screening ODC inhibitor.

L-ornithine decarboxylase;L-ornithine decarboxylase inhibitor;screening model

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.005

050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院ICU室(郝秀菊)，科教科(王鋒)；河北省藁城市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科(劉志輝)；河北省石家莊市井陘礦區(qū)疾病預(yù)防控制中心(欒文姬)；石藥集團(tuán)河北中潤(rùn)制藥有限公司(蘇麗娜、陳俊峰)

R 965.1

A

1002-7386(2014)21-3217-03

2014-04-11)