HPLC法測定鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿中的蛋白結合率

王艷梅 李秀輕 王俊學

·藥物研究·

HPLC法測定鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿中的蛋白結合率

王艷梅 李秀輕 王俊學

目的研究鹽酸雷諾嗪與不同種屬血漿的蛋白結合情況。方法采用高效液相色譜法(HPLC法)和平衡透析法測定管狀半透膜內(nèi)的血漿藥物濃度及管狀半透膜外的緩沖液中藥物濃度，并計算蛋白結合率。結果鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿(大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白)中的蛋白結合率均大于50%，分別為：大鼠血漿：(63.43±1.9)%；人血漿：(61.58±4.1)%；牛血清白蛋白：(62.16±2.9)%。且鹽酸雷諾嗪在各種屬血漿中最低定量下限均為0.05 mg/L。結論鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿(大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白)中的蛋白結合率及蛋白結合藥物的表觀最大能力均較高。隨著藥物血漿濃度升高，鹽酸雷諾嗪結合率升高，有較強的濃度依賴性。

鹽酸雷諾嗪；蛋白結合率；半透膜；平衡透析法；高效液相色譜法

鹽酸雷諾嗪為吡嗪類抗心絞痛藥，具有全新的抗心絞痛機制，是一種晚鈉離子電流選擇性阻滯劑，通過改善缺血心肌細胞代謝和氧的利用，達到抗心肌缺血、抗心律失常和抗心力衰竭作用[1]，該藥于2006 年1月獲得FDA批準在美國正式上市[2]，主要用于治療慢性心絞痛。目前，國內(nèi)文獻中關于鹽酸雷諾嗪在不同種屬不同濃度血漿中蛋白結合的研究筆者未見報道，本研究通過探索鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿中蛋白結合情況，進一步為該藥在藥效、藥動學等方面的行為差異提供理論和實驗依據(jù)[3]。

1 儀器與試藥

Waters公司1525-2487型高效液相色譜儀(美國)：1525泵，2487紫外檢測器；XW-80型旋渦混合器(上海)；管狀半透膜(北京華美，型號：DM-6(MD-10)USA)。

鹽酸雷諾嗪對照品(購自上海凱峰化工有限公司，批號:060811)；內(nèi)標：苯海拉明(批號：1006631-20089705)由中國藥品生物制品檢定所提供。大鼠(河北省實驗動物中心提供)；人血漿(河北省血液中心提供，批號：0050107040084)；BSA(Sino-American Biofee公司)。甲醇為色譜純，水為二次重蒸水，其他所用試劑均為分析純試劑。

2 方法

2.1 溶液的配制 對照品溶液：取鹽酸雷諾嗪和苯海拉明對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇、水溶解配制成濃度為50 mg/L的鹽酸雷諾嗪對照品溶液和50 mg/L的苯海拉明對照品溶液。BSA溶液：稱取BSA適量，用重蒸水稀釋成濃度為45 g/L的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：RESTEKCR C18色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；流動相為甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液， pH值4.5)(55∶45)，流速為1 ml/min，檢測波長為272 nm，柱溫為35℃，進樣量為20 μl。見圖1。

圖1 鹽酸雷諾嗪在空白人血漿和磷酸鹽緩沖液中的色譜圖

A.空白血漿；B.鹽酸雷諾嗪與內(nèi)標的血漿樣品；C.空白緩沖鹽；D.鹽酸雷諾嗪與內(nèi)標的透析袋外樣品；1-內(nèi)標苯海拉明；2-鹽酸雷諾嗪

2.3 樣品處理 透析袋內(nèi)血漿和透析袋外緩沖液分別取0.3 ml，分置5 ml離心管中，以5 mol/L的NaOH溶液50 μl堿化樣品后，渦旋10 s混勻，精密加入50 mg/L的苯海拉明溶液50 μl，渦旋10 s， 用3 ml乙醚溶液萃取，渦旋15 s，離心(2 000×g)5 min。 取上清液2.5 ml，N2吹干，40 μl流動相溶解，進樣，記錄鹽酸雷諾嗪及苯海拉明的色譜峰面積。

2.4 方法學考察

2.4.1 鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿及pH值7.4磷酸鹽緩沖液中的標準曲線：精密稱取“2.1” 項下鹽酸雷諾嗪溶液適量，加至各血漿和磷酸鹽緩沖液中，分別配制成0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L和0.005，0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.5 mg/L濃度的溶液，混合均勻。上述溶液各精密量取0.3 ml，分置5 ml離心管中，按“2.3”項下方法處理后進樣測定，記錄色譜圖。用鹽酸雷諾嗪與內(nèi)標的峰面積比(Y)對上述相應濃度(X)進行線性回歸。鹽酸雷諾嗪在各種屬血漿中最低定量下限均為0.05 mg/L，在磷酸鹽中最低定量下限為0.005 mg/L。見表1。

表1 鹽酸雷諾嗪在不同介質(zhì)中的回歸方程、相關系數(shù)與線性范圍

2.4.2 回收率與精密度試驗：按“2.3樣品處理”項下方法，在各血漿和磷酸鹽緩沖液中加入“2.1” 項下鹽酸雷諾嗪溶液，配制成濃度為0.1、1.0、4.0 mg/L的血漿樣品和濃度為0.01、0.1、0.4 mg/L的磷酸鹽緩沖液樣品，按上述色譜條件測定，計算得鹽酸雷諾嗪在3種濃度不同介質(zhì)中，回收率、日內(nèi)及日間RSD均小于15%，符合生物樣品分析要求。

2.4.3 提取回收率和基質(zhì)效應：在4種不同介質(zhì)中，分別配制鹽酸雷諾嗪上述低、中、高3種濃度的樣品，以提取后的藥物峰面積與直接進樣的鹽酸雷諾嗪峰面積之比計算提取回收率。同上用流動相代替上述4種介質(zhì)，按“2.3”項下方法(無內(nèi)標)測定，記錄峰面積為Y1。另取4種不同介質(zhì)按“2.3”項下方法處理后，加入低、中、高3種濃度的標準品溶液，按上述色譜條件測定，記錄鹽酸雷諾嗪的峰面積為Y2。計算基質(zhì)效應ME=Y2/Y1×100%。結果3種濃度不同介質(zhì)中鹽酸雷諾嗪的提取回收率RSD均小于15%，符合生物樣品分析要求。且基質(zhì)效應對樣品測定沒有影響。

2.4.4 穩(wěn)定性考察：在4種介質(zhì)中分別加入鹽酸雷諾嗪標準液，配制上述低、中、高3種濃度樣品，每個濃度平行配制5份樣品，按“2.3”項下方法，室溫放24 h及在-20℃冷凍10 d，并且三次冷凍-解凍后考察上述樣品的穩(wěn)定性。結果3種濃度樣品在上述條件下的4種不同介質(zhì)中均穩(wěn)定，相對誤差RE均在 ± 10%之內(nèi)，RSD < 15%，符合生物樣品的分析要求。

2.5 人標準血漿和大鼠中蛋白總量的測定

2.5.1 標準曲線[4]：取”2.1”項下BSA溶液，用純化水稀釋成10、30、50、70、90 μg/ml系列濃度的溶液，采用Lowry法(中國藥典2005年版)，于650 nm波長處測定標準蛋白溶液的吸光度(A)。以A對血漿蛋白溶液濃度(C)作線性回歸，得回歸方程為：A=0.0027C-0.0011，r=0.9996(n=5)。

2.5.2 蛋白總量測定：取大鼠及人血漿，用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度100 mg/L以內(nèi)，取1.0 ml置10 ml試管中，按“2.5.1”項下操作，測定A。以標準曲線法計算，測得試驗所用大鼠和人血漿中的蛋白總量分別為55.20 g/L和75.52 g/L。

2.6 血漿蛋白結合率的測定

2.6.1 實驗方法：采用平衡透析法[5]測定。在裝有磷酸鹽緩沖液的試管中，分別放置裝有0.5 ml各濃度含藥血漿(0.25、0.5、1.0、2.5 mg/L)的透析袋，在4℃的冰箱內(nèi)透析至平衡后，用三氯醋酸試劑檢查袋外透析液有無蛋白漏出。按“2.3”項下方法取透析袋兩側(cè)介質(zhì)進行測定，以標準曲線法計算藥物濃度。

另取8份，其中4份袋內(nèi)外均為磷酸鹽緩沖液，袋內(nèi)藥物濃度為1.0 mg/L；另外4份未用半透膜，將藥物直接加至磷酸鹽緩沖液，觀察藥物和透析袋之間的結合情況。另取4份，在透析袋內(nèi)外只含磷酸鹽緩沖液的情況下，考察透析袋對測定的影響。結果表明，藥物與透析袋之間，以及透析袋本身均不影響測定結果。

2.6.2 測定透析平衡時間：透析袋內(nèi)外均加磷酸鹽緩沖液，其中袋內(nèi)含鹽酸雷諾嗪(1 mg/L)，共20份，分成5組，分別于24、48、72、96 h于袋兩側(cè)取樣，照“2.3”項下方法測定。不同時間血漿蛋白結合率分別為：(36.5±4.1)%、(78.1±4.4)%、(94.6±3.3)%、(95.7±3.8)%。應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析結果，最終確定72 h為透析達平衡時間。

2.6.3 蛋白結合率：用上述方法對鹽酸雷諾嗪(4種質(zhì)量濃度)樣品透析平衡后，測定透析袋內(nèi)外藥物總濃度(Dt、Df)。根據(jù)公式：fb=(Dt-Df)/Dt×100%計算血漿蛋白結合率。結果表明，鹽酸雷諾嗪與各種屬血漿的蛋白結合率均大于50%，且蛋白結合率隨藥物濃度的增加而升高。見表2。

表2 不同種屬血漿中的蛋白結合率 ±s

2.6.4 計算βp及Kdp[6]：根據(jù)公式：Df=βp×[P]·Df/(Df+Dt-Df·W)-Kdp計算出蛋白結合藥物的表觀最大能力(βp)和藥物與蛋白復合物的解離常數(shù)(Kdp)，其中Dt和Df需要折合成摩爾濃度進行計算，W為血漿中的含水量，[P]單位為g/L。以Df作縱坐標(Y)，[P]·Df/(Df+Dt-Df·W)作橫坐標(X)，進行線性回歸，大鼠蛋白結合藥物的表觀最大能力和解離常數(shù)均最大。表明鹽酸雷諾嗪與各血漿蛋白結合參數(shù)之間有很大的差異，因此在臨床研究中應考慮到不同種屬之間的區(qū)別。見表3。

表3 鹽酸雷諾嗪與各種屬血漿蛋白的βp及Kdp

3 討論

藥物與血漿蛋白結合率的研究越來越引起重視，涉及到的測定方法有平衡透析法、超速離心法和白蛋白微球測定法等，因為平衡透析法操作簡單，測定結果穩(wěn)定，故本文采用平衡透析法。

試驗中對流動相的選用[乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值4.0)、甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值4.5)、甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值5.5)]和樣品處理時的萃取溶劑(石油醚、乙醚和乙酸乙酯)進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，流動相中加入醋酸-醋酸銨緩沖溶液(pH值4.5)，不僅可以改善峰形，而且更利于分離，故最終確定流動相為甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值4.5)。通過比較不同萃取溶劑時血漿中鹽酸雷諾嗪的提取回收率，發(fā)現(xiàn)乙醚做萃取溶劑時回收率最高，且萃取后較容易揮干，故最終確定乙醚為提取溶劑。

本文通過建立鹽酸雷諾嗪血漿蛋白結合率的HPLC測定方法，計算不同種屬血漿蛋白的相關參數(shù)，為鹽酸雷諾嗪的臨床應用提供了理論和實驗依據(jù)，對該藥在國內(nèi)的應用奠定了實驗基礎。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.057

063000 河北省唐山市，中國人民解放軍第255醫(yī)院藥械科(王艷梅、王俊學)；河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院肝膽外科(李秀輕)

R 914.1

A

1002-7386(2014)21-3339-03

2014-05-11)