EZH2與PCNA、P16蛋白在胃癌組織中表達的關系和意義

高德全 趙彥婷 劉云云 冀增海

·論著·

EZH2與PCNA、P16蛋白在胃癌組織中表達的關系和意義

高德全 趙彥婷 劉云云 冀增海

目的檢測EZH2、增殖細胞核抗原(PCNA)、P16蛋白在胃癌及癌旁正常組織中的表達情況，分析EZH2與患者臨床病理特征及預后的關系。方法收集62例胃癌手術患者的腫瘤及52例癌旁正常胃粘膜組織石蠟標本進行免疫組織化學染色，并收集患者的臨床病理特征及隨訪資料，同時檢測PCNA、P16蛋白的表達，分析這3種蛋白質之間的關系；分析EZH2與胃癌患者臨床病理特征及預后的關系。結果胃癌組織中EZH2、PCNA表達均較癌旁組織明顯增強(P<0.05)，P16蛋白在胃癌組織中表達明顯低于癌旁組織陽性率(P<0.05)；胃癌組織中EZH2與PCNA表達有正相關關系(r=0.3846，P=0.002)，EZH2與P16蛋白表達存在負相關關系(r=-0.2756，P<0.05)；PCNA與P16表達無明顯相關關系(P>0.05)。EZH2表達與胃癌腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)；預后分析顯示，EZH2強表達患者的生存期比弱表達者明顯縮短(P<0.05)。結論胃癌組織中EZH2蛋白表達明顯增高，與胃癌部分臨床病理特征有關，EZH2蛋白還可以作為預后指標；EZH2蛋白在胃癌中的作用可能與其調節腫瘤細胞增殖能力有關。

胃癌；果蠅zeste 基因增強子同源物2；增殖細胞核抗原；P16蛋白；臨床病理特征；預后

胃癌是我國發病率、病死率最高的消化道惡性腫瘤，對人民健康危害極大，但胃癌并無特異性臨床表現，很難早期發現，患者就診時多已處于進展期，手術及化療效果不佳，預后較差。目前胃癌發病機制尚不明確，尋找與胃癌發生進展關系密切的基因有可能作為新腫瘤標志物對胃癌進行診斷及預后預測，還可能確定腫瘤生物治療靶點。此類研究已成為胃癌研究熱點，但尚未取得突破性進展。果蠅zeste 基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是新近發現的原癌基因，與多種惡性腫瘤發生進展有關[1-3]，但關于EZH2蛋白與胃癌臨床病理特征及預后關系的研究還比較少見。故本研究應用免疫組化技術檢測比較了EZH2蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，同時分析了EZH2表達與胃癌臨床病理特征各指標之間的關系，并探討EZH2蛋白與胃癌預后的關系；同時應用免疫組化技術檢測了與胃癌組織中與腫瘤增殖關系密切的增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、P16蛋白的表達，探討了EZH2蛋白與PCNA、P16的關系及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2005年8月至2011年7月確診為胃癌行手術切除腫瘤并術后病理證實的患者胃癌石蠟標本62例，其中52例有癌旁正常組織。所有患者臨床病理資料完整，患者術前均未接受放、化治療，均有術后隨訪資料。其中男48例，女14例；年齡37～72歲，平均年齡(59.2±11.3)歲。兔抗人EZH2、PCNA、P16多克隆抗體均購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術公司。

1.2 免疫組化染色 組織均為4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋后4 μm連續切片，進行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)和免疫組化SP染色。切片經脫蠟水化、3%過氧化氫孵育、蒸餾水沖洗等過程后PBS浸泡進行抗原修復。免疫組化試劑盒操作過程：封閉、分別加入各一抗、孵育、沖洗后依次加二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹脂封片。

1.3 免疫組化結果判斷標準 SP染色結果由兩位病理專業醫師雙盲閱片判斷。每張切片隨機取5個400倍視野，每視野計數100個細胞，根據細胞染色的陽性率計算評分。EZH2、PCNA蛋白以細胞核出現黃褐色或棕褐色為染色陽性，P16蛋白以細胞漿或細胞膜出現黃褐色或棕褐色為染色陽性。記分標準如下：細胞內陽性表達率<10%記為陰性，陽性細胞表達≥10%記為陽性。

1.4 統計學分析 應用SAS 8.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗、Spearman相關分析、Kaplan-Meier生存分析方法對實驗數據進行處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌與癌旁正常組織中EZH2、PCNA、P16的免疫組化結果 免疫組化結果顯示，胃癌組織EZH2、PCNA表達與癌旁正常組織比較明顯增高，P16在胃癌組織中表達明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。Spearman相關結果顯示，胃癌組織中EZH2與PCNA表達存在正相關關系(r=0.3846，P=0.002)，EZH2與P16表達有負相關關系(r=-0.2756，P=0.030)；PCNA與P16表達無明顯相關關系(r=-0.2108，P=0.100)。

表1 EZH2、PCNA、P16在胃癌和癌旁組織中表達情況 例

2.2 EZH2蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系 單因素分析顯示，EZH2蛋白與胃癌腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。EZH2蛋白與性別、年齡、腫瘤直徑、神經血管侵犯、遠處轉移等特征無明顯關系(P>0.05)。見表2。

表2 胃癌組織EZH2表達與腫瘤臨床病理特征的關系 例

2.3 EZH2蛋白表達與胃癌患者預后的關系 62例胃癌患者有51例得到隨訪，隨訪截止日期為2011年8月，隨訪率為82.3%。應用Kaplan-Meier生存分析檢驗，EZH2蛋白表達陽性患者的平均生存期為(20.17±1.92)月，EZH2陰性者平均生存期為(31.90±3.09)月，2組比較差異有統計學意義(χ2= 5.944,P=0.0148)。見圖1。

3 討論

胃癌由于起病隱匿、特異性癥狀不明顯，不易早期診斷。且胃癌進展迅速，患者出現癥狀就診時往往已處于中晚期，綜合治療效果不佳。近年胃癌手術、化療技術雖有了較大進步，但我國胃癌患者5年生存率仍僅為30%～40%。由于胃癌發病機制尚不明確，因此尋找與胃癌發生進展有關的新基因意義重大。EZH2即是受到關注的基因之一。研究顯示，EZH2蛋白具有癌基因特征，在多種惡性腫瘤中表達上調，EZH2基因可促進腫瘤的增殖、侵襲、血管生成能力，與膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌等腫瘤進展有關[1,4,5]。而有關EZH2蛋白與胃癌臨床病理特征及預后關系的研究目前尚不多見。本結果發現，EZH2蛋白在胃癌組織中表達比癌旁正常組織增強，說明EZH2可能促進胃癌腫瘤的發生、進展。對EZH2蛋白與胃癌各項臨床病理特征的關系進行分析，結果發現EZH2蛋白表達陽性的患者與EZH2蛋白陰性者相比腫瘤浸潤更深、分化程度更差、臨床分期更晚、淋巴結轉移率更高，這說明EZH2蛋白可能促進胃癌轉移進展。進一步預后分析顯示，EZH2蛋白表達陽性的胃癌患者生存期較陰性者短，提示EZH2蛋白可以作為胃癌預后指標。但本研究樣本量較小，有待進一步擴大研究規模并進行前瞻性研究，以便對EZH2蛋白在胃癌中的臨床意義予以闡明。

圖1 EZH2表達與胃癌患者預后關系的Kaplan-Meier生存分析結果

為了解EZH2蛋白促進胃癌細胞增殖的機制，本研究同時檢測了與直接反映腫瘤細胞增殖能力的PCNA、P16蛋白的表達。腫瘤細胞中PCNA表達增強，該蛋白在分裂期細胞中表達增高，在靜止期細胞中無明顯表達，可作為評價細胞增殖狀態的指標，直接反映細胞的增殖狀態。研究表明，PCNA在惡性腫瘤中通過促進腫瘤細胞增殖而使腫瘤進展[6,7]。有研究顯示，惡性腫瘤中EZH2蛋白可通過促進PCNA表達而促進腫瘤細胞的增殖[8]。本結果顯示，PCNA在胃癌

中的表達強于癌旁組織，EZH2蛋白與PCNA表達有正相關關系，與前述報道的結果符合。P16蛋白特異性作用于細胞周期G1期，可以阻止G1期細胞進入S期從而抑制細胞增殖。P16蛋白功能缺失可導致細胞過度增殖甚至癌變，多種惡性腫瘤中P16蛋白表達均明顯降低[9,10]。本研究也證實P16蛋白在胃癌中表達明顯低于癌旁組織，且EZH2與P16蛋白有負相關關系，提示EZH2可能通過抑制P16蛋白而發揮促進胃癌細胞增殖作用，但具體機制還需要進行深入研究。

本研究發現EZH2蛋白表達與胃癌部分臨床病理特征有關系，EZH2蛋白陽性表達可作為胃癌不良預后因子。EZH2蛋白參與胃癌進展可能與EZH2蛋白調節PCNA、P16表達有關。但本研究樣本量較小，且僅對臨床現象進行了觀察分析，具體機制還不明確。因此，進一步研究中我們準備擴大樣本數，并對EZH2蛋白進行功能和機制研究，闡明EZH2蛋白在胃癌中的具體作用。

1 Li K,Liu C,Zhou B,et al.Role of EZH2 in the Growth of Prostate Cancer Stem Cells Isolated from LNCaP Cells.Int J Mol Sci,2013,14:11981-11993.

2 Heyn H,Esteller M.EZH2:An Epigenetic Gatekeeper Promoting Lymphomagenesis.Cancer Cell,2013,23:563-565.

3 Shen L,Cui J,Liang S,et al.Update of research on the role of EZH2 in cancer progression.Onco Targets Ther,2013,6:321-324.

4 Seward S,Semaan A,Qazi AM,et al.EZH2 blockade by RNA interference inhibits growth of ovarian cancer by facilitating re-expression of p21(waf1/cip1) and by inhibiting mutant p53.Cancer Lett,2013,336:53-60.

5 Zhong J,Min L,Huang H,et al.EZH2 regulates the expression of p16 in the nasopharyngeal cancer cells.Technol Cancer Res Treat,2013,12:269-274.

6 Ou JM,Qui MK,Dai YX,et al.Combined blockade of AKT/mTOR pathway inhibits growth of human hemangioma via downregulation of proliferating cell nuclear antigen.Int J Immunopathol Pharmacol,2012,25:945-953.

7 Zafar H,Ali S.Boron inhibits the proliferating cell nuclear antigen index,molybdenum containing proteins and ameliorates oxidative stress in hepatocellular carcinoma.Arch Biochem Biophys,2013,529:66-74.

8 French BA,Oliva J,Bardag-Gorce F,et al.Mallory-Denk bodies form when EZH2/H3K27me3 fails to methylate DNA in the nuclei of human and mice liver cells.Exp Mol Pathol,2012,92:318-326.

9 Srivastava V,Patel B,Kumar M,et al.Cyclin D1,Retinoblastoma and p16 Protein Expression in Carcinoma of the Gallbladder.Asian Pac J Cancer Prev,2013,14:2711-2715.

10 Saito Y,Yoshida M,Ushiku T,et al.Prognostic value of p16 expression and alcohol consumption in Japanese patients with oropharyngeal squamous cell carcinoma.Cancer,2013,119:2005-2011.

ThesignificanceofexpressionofEZH2,PCNA,P16ingastriccanceranditscorrelationwithpatient’sprognosis

GAODequan*,ZHAOYanting,LIUYunyun,etal.*TheFirstDepartmentofSurgery,People’sHospitalofPingshanCounty,Hebei,Pingshan050400,China

ObjectiveTo investigate the significance of expression of EZH2,proliferating cell nuclear antigen (PCNA),P16 in gastric cancer tissues and its correlation with clinicopathological characteristics and prognosis of patients.MethodsThe expression levels of EZH2,PCNA,P16 were tested by immunohistochemistry in 62 cases of gastric cancer tissues and 52 cases of tumor-adjacent tissues,and patients’ clinicopathological characteristics and follow-up data were collected.The correlation among the three kinds of proteins was analyzed,and the relationship between EZH2 and clinicopathological characteristics as well as prognosis of patients was analyzed.ResultsThe expression levels of EZH2 (69.35%) and PCNA (83.87%) in gastric cancer tissues were significantly higher than those (21.15%,38.46%) in tumor-adjacent tissues (P<0.05),however,the expression levels of P16 (33.87%) in gastric cancer tissues were significantly lower than those in tumor-adjacent tissues (73.08%,P<0.05).The expression levels of EZH2 were positively correlated with those of PCNA in gastric cancer tissues,however,the expression levels of EZH2 were negatively correlated to those of P16 (P<0.05),moreover,there was no obvious relationship between the expression of PCNA and that of P16 (P>0.05).The overexpression of EZH2 was related to the depth of tumor infiltration,differentiation degree,clinical TNM stage,lymph node metastasis (P<0.05).Prognosis analysis showed that that the survival duration in patients with overexpression of EZH2 was obviously shorter than that of patients with weak expression of EZH2 (P<0.05).ConclusionThe overexpression of EZH2 appears in gastric cancer tissues,which is related to clinicopathological characteristics of gastric cancer,moreover,EZH2 protein can be served as an index of prognosis evaluation,and its effect in gastric cancer may be correlated to regulating proliferation ability of tumor cells.

gastric cancer;enhancer of zeste homolog 2;proliferating cell nuclear antigen;P16 protein;clinicopathological characteristics;prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.003

050400 河北省平山縣人民醫院外一科(高德全)，婦科(趙彥婷)，骨科(劉云云)，外三科(冀增海)

R 735.2

A

1002-7386(2014)04-0492-03

2013-09-12)