歸膠顆粒毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

★ 張小波 游劍 龔建平 曾燕斌

(1.江西美媛春藥業(yè)股份有限公司 永豐 331500;2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 330006)

貧血是全球最為普遍的疾病。2008年世界衛(wèi)生組織全球貧血數(shù)據(jù)庫(kù)公布的《1993年至2005年貧血患病率》顯示，全世界受貧血影響的人數(shù)達(dá)到16.2億，占世界人口的24.8%；貧血患病率在學(xué)齡前兒童最高(為47.4%)，成年男子的患病率最低(為12.7%)，成年女性中，孕婦患病率為41.8%，非孕婦為30.2%。而據(jù)2002年全國(guó)第四次營(yíng)養(yǎng)調(diào)查，我國(guó)居民貧血患病率為20.1%，男性為15.8%，女性為23.3%。歸膠顆粒是針對(duì)貧血人群而組方的補(bǔ)血產(chǎn)品，配方主要由當(dāng)歸、阿膠等組成。為了探討歸膠顆粒作為保健食品開(kāi)發(fā)的可行性，筆者按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)對(duì)其進(jìn)行了毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，作為該產(chǎn)品食用的安全性依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 歸膠顆粒，自制，人體口服推薦劑量為200 mg/kg.bw。

1.1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(贛)2005-0001。

1.1.3 試驗(yàn)菌種 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源于湖南省疾病預(yù)防控制中心。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 昆明種小鼠，雌、雄各10只，18-22 g。采用最大耐受量法，試驗(yàn)前動(dòng)物禁食16 小時(shí)。取受試物內(nèi)容物(相對(duì)密度為1.0 g/mL)，按20.0 mL/kg﹒bw一次經(jīng)口灌胃。灌胃后連續(xù)觀察7 天，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.2.2 鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)(Ames試驗(yàn)) 采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株進(jìn)行試驗(yàn)。五個(gè)試驗(yàn)劑量分別為5 000、1 000、200、40、8 μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變、溶劑對(duì)照(蒸餾水)和陽(yáng)性突變劑對(duì)照。樣品配制時(shí)，取受試物1.25 g溶于25 mL蒸餾水中，取100 μL加入平皿即為最高受試物濃度(5 000 μg/皿)，其他濃度受試液用蒸餾水稀釋出。試驗(yàn)采用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶(S-9)作為體外代謝活化系統(tǒng)。在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL受試液和0.5 mLS-9混合液(當(dāng)需要代謝活化時(shí))，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。37 ℃培養(yǎng)48 小時(shí)，計(jì)數(shù)每皿菌落數(shù)。

1.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 昆明種小鼠，雌、雄各25只，25-30 g。按體重隨機(jī)分為5組，陰性對(duì)照組(蒸餾水)、歸膠顆粒10 000、5 000和2 500 mg/kg.bw組、陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)磷酰胺，40 mg/kg.bw)組，每組雌、雄各5只。稱取6.25 g、12.50 g、25.00 g受試物加蒸餾水至50 mL，另稱100 mg環(huán)磷酰胺加蒸餾水至50mL。灌胃體積按20 mL/kg.bw，采用30 小時(shí)2次灌胃法(間隔24小時(shí))，第2次灌胃后6小時(shí)取胸片制片鏡檢。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 雄性昆明種小鼠25只，25-35 g。按體重隨機(jī)分成5組，陰性對(duì)照組(蒸餾水)、歸膠顆粒10 000、5 000和2 500 mg/kg.bw組、陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)磷酰胺，40 mg/kg.bw)組，每組5只。以20 mL/kg.bw灌胃，連續(xù)5 天，每天1次，于末次灌胃后第30 天取兩側(cè)副睪制片鏡檢。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 畸形試驗(yàn)和微核試驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

以20.0 g/kg.bw劑量的歸膠顆粒灌胃兩種性別的小鼠未見(jiàn)明顯中毒癥狀，觀察期內(nèi)動(dòng)物各系統(tǒng)無(wú)異常發(fā)現(xiàn)，也無(wú)死亡。歸膠顆粒對(duì)雌、雄昆明種小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)最大耐受劑量(MTD)大于20.0 g/kg.bw(見(jiàn)表1)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬無(wú)毒級(jí)。

表1 歸膠顆粒對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性

2.2 Ames試驗(yàn)

由表2、表3可見(jiàn)，在本試驗(yàn)的各濃度下，無(wú)論是否加入S-9混合液，各皿回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，并且未見(jiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，而各陽(yáng)性對(duì)照組均顯示強(qiáng)烈的誘變作用。根據(jù)Ames試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，本次試驗(yàn)測(cè)試的歸膠顆粒無(wú)致突變作用。

表2 歸膠顆粒第1次Ames試驗(yàn)結(jié)果±s)

表3 歸膠顆粒第2次Ames試驗(yàn)結(jié)果±s)

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表4可見(jiàn)，樣品各劑量組微核率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果，本次試驗(yàn)測(cè)試的歸膠顆粒在上述劑量下未見(jiàn)致突變作用。見(jiàn)表4。

表4 歸膠顆粒小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果±s)

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表5可見(jiàn)，樣品各劑量組小鼠精子畸形發(fā)生率未產(chǎn)生明顯改變，與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺組)與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)。說(shuō)明本次檢測(cè)的歸膠顆粒對(duì)小鼠精子無(wú)致突變作用。

表5 歸膠顆粒小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果±s，n=5)

3 討論

當(dāng)歸和阿膠均始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是臨床常用的中藥材，具有較好的補(bǔ)血功效，其中阿膠是藥食兩用的物品，當(dāng)歸也已入選我國(guó)衛(wèi)生部2002年公布的“可用于保健食品的物品”名單?，F(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸的主要成分為精油(藁本內(nèi)酯等)和水溶性成分(阿魏酸等)，此外還含有19種氨基酸、23種微量元素及多糖，其中當(dāng)歸多糖可促進(jìn)血紅蛋白和紅細(xì)胞的生成[1]。阿膠具有升高紅細(xì)胞和血紅蛋白的作用，可促進(jìn)造血功能；能升高白細(xì)胞、血小板和升高血氧含量；有擴(kuò)張微血管、擴(kuò)大血容量、降低全血粘度和降低血管壁通透性的作用[2]。以當(dāng)歸、阿膠等為主要原料，加工制成的歸膠顆粒，含有豐富的中藥補(bǔ)血活性成分，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過(guò)小鼠口服急性毒性試驗(yàn)表明，歸膠顆粒最大耐受劑量(MTD)大于20 g/kg.bw，屬無(wú)毒級(jí)。三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)(Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn))結(jié)果均為陰性，表明歸膠顆粒對(duì)體細(xì)胞無(wú)致誘變及突變作用。

[1]鄧永健，郭志偉，王萌.當(dāng)歸的化學(xué)成份及其藥理作用研究進(jìn)展[J].新疆中醫(yī)藥，2006，24(5) :109-113.

[2]楊福安，王京娥.阿膠的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(5) :467-468.