真核表達載體pEGFP—N1—kin17的構建及其在Zmpste24—/—小鼠胚胎成纖維細胞內的表達

鄭慧玲　崔紅晶　余磊等

[摘要]目的 構建人kin17基因真核表達載體pEGFP-N1-kin17，將載體轉染至野生型及Zmpste24基因缺失的小鼠胚胎成纖維上皮細胞，熒光顯微鏡觀察kin17蛋白表達情況。 方法 用高保真DNA 聚合酶，從pCMV-kin17載體中擴增獲取人kin17 cDNA編碼序列，將其克隆至pEGFP-N1載體中，經酶切、連接、轉化后，挑取陽性克隆進行菌液進行PCR、菌液質粒雙酶切及測序鑒定；將成功構建的GFP-kin17表達載體轉染Zmpste24-/- MEFs，熒光顯微鏡觀察kin17蛋白的核定位情況。 結果 pEGFP-N1-kin17轉化細菌克隆測序結果完全正確；將載體轉入MEFs后，可以通過熒光顯微鏡觀察到kin17蛋白的表達。 結論 成功構建GFP融合的kin17真核表達載體，該載體為kin17蛋白的研究提供工具。本實驗中載體pEGFP-N1-kin17在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均成功表達。

[關鍵詞] kin17；GFP；Zmpste24；小鼠胚胎成纖維細胞

[中圖分類號] R346 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）13-34-05

[Abstract] Objective To construct the kin17 GFP fusion eukaryotic expression vector and explore the expression and location of kin17 in Zmpste24-/- mouse embryonic fibroblasts （MEFs）. Methods cDNA fragment of kin17 was amplified from pCMV-kin17 by PCR and cloned into GFP fusion eukaryotic expression vector pEGFP-N1. The positive clone was confirmed by sequencing. Zmpste24-/- and wild type MEFs were obtained from 13.5 d pregnant Zmpste24+/- female mouse. The recombinant plasmid was transiently transfected into Zmpste24-/- MEFs with LipofectamineTM2000. The protein expression of kin17 was detected by fluorescence microscopy. Results Eukaryotic expression vector pEGFP-N1-kin17 containing coding region of human kin17 gene was successfully constructed. Zmpste24-/- and wild type MEFs were identified by PCR and western blotting genotyping. Zmpste24-/- and wild type MEFs transfected with the recombinant plasmid expressed high level of recombinant kin17 protein was detected by fluorescence microscopy. Conclusion The construction of pEGFP-N1-kin17 was successfully achieved and the expression of GFP-kin17 was located in the nucleus of Zmpste24-/- and wild type MEFs.

[Key words] kin17； GFP； Zmpste24； Mouse embryonic fibroblasts

Kin17（from immunological kinship to Rec A Protein，clone17）蛋白是一種普遍表達的核蛋白，從酵母到人均可檢測到kin17蛋白的表達。Kin17蛋白與DNA直接結合，參與DNA合成；同時kin17也具有和RNA直接結合的結構，類SH3（src homology 3）的結構域，因此kin7可能是細胞核內功能調節的重要蛋白質。Kin17在細胞增殖期表達量最高[1-4]。在DNA損傷因素處理后，kin17蛋白的表達量明顯上調，提示kin17蛋白可能參與DNA損傷修復，因此它被稱為應激蛋白[5]。本研究小組前期通過酵母雙雜交方法，以lamin A為誘餌蛋白，從人骨骼肌文庫中釣取相互作用蛋白。Kin17為其中之一的陽性克隆。通過內源性免疫共沉淀，我們再次驗證了kin17和lamin A是相互作用蛋白。 Zmpste24 [Zinc Metallopeptidase（STE24 Homolog，Yeast）]，是lamin A蛋白成熟過程中必須的基質金屬蛋白酶。Zmpste24敲除（Zmpste24-/-）模型小鼠因不能順利剪切lamin A前體prelamin A蛋白，造成體內大量prelamin A堆積，導致小鼠產生許多以早老表型為主的病理特征。在Zmpste24-/-細胞水平，則觀察到細胞核異常、基因組不穩定性等病理現象[6-8]。本實驗構建pEGFP-N1-kin17，并將載體轉染Zmpste24-/-小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts， MEFs），為進一步深入探討kin17和lamin A的相互關系建立了一個有效的細胞實驗模型。endprint

1 材料與方法

1.1 MEFs分離和傳代

孕13.5 Zmpste24+/-雌小鼠由香港大學周中軍教授饋贈。實施斷頸法處死孕小鼠，無菌條件下取出小鼠胚囊，逐一分離，置于3.5cm的培養皿中。除去胚胎頭部及內臟組織后（收取部分做基因型鑒定），每個胚胎加入1mL胰蛋白酶-EDTA后用眼科剪將組織剪碎，并在37℃孵育約15min。隨后將細胞組織懸液轉移至一個15cm培養皿中，加入20mL含10%胎牛血清的DMEM培養液，終止胰酶消化，在培養箱中過夜培養，次日更換培養基。細胞長到80%～90%匯合時并仍處于指數生長期時，凍存細胞或將細胞傳代。傳代時棄去培養液，PBS緩沖液清洗細胞，1mL 5%胰酶-EDTA 37℃消化5min。隨后加入上述DMEM培養液5mL，輕輕吹打細胞，使細胞脫離培養皿表面，離心回收細胞后，可根據實驗將細胞1︰3至1︰5稀釋移至新的培養皿中，或用血球計數板計數，接種相應的細胞數量至實驗所需的不同的細胞培養皿中，加入適量培養液在37℃ 5%CO2培養箱培養。

1.2 MEFs基因型鑒定

1.2.1 基因水平鑒定方法 PBND法[50mM KCl，10mM Tris-HCL（pH8.3）， 2.5mM MgCl2， 0.1mg/mL gelatin， 0.45%（v/v） Nonident P40，0.45%（v/v） Tween 20]溶解收取的部分小鼠胚胎組織，加入蛋白酶K（20mg/mL），55℃過夜。次日沸水煮樣本5min，離心取上清1～5?L作為PCR模板。PCR引物：共同上游引物GTCTCCTCGTGATGTCACAACTTTG，野生型下游引物GGAGCGGATCTCAAA CTCTCCTC，突變型下游GAATCCAAACATGACCTTCCCCT。反應條件按照Taq DNA Polymerase（Takara）說明書進行，具體為：94℃ 10s，60℃15s，72℃ 30s，30 Cycles。

1.2.2 蛋白水平鑒定方法 1.1培養的MEFs中取部分細胞，胰酶消化收集細胞，1×PBS清洗細胞，離心回收細胞后加入含蛋白酶抑制劑（Merck）的RAPI 裂解緩沖液（0.5% Nonidet P-40，150 mM NaCl，100mM DTT and 50 mM Tris-HCl，pH 8.0）在冰上裂解細胞。細胞裂解液加入蛋白上樣緩沖液后在沸水中加熱樣品3min使蛋白變性。制備SDS-PAGE膠，每孔上樣10μL進行電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白電轉移至PVDF膜（Millipore），5%脫脂牛奶封閉劑，室溫孵育1h；加入1︰5 000稀釋的laminA/C （H-110）多克隆抗體（Santa Cruz）室溫孵育2h；加入1︰5 000稀釋的HRP二抗（Bethyl），室溫孵育1h。最后加入ECL發光試劑于PVDF膜上，用X光片曝光及顯影定影，獲得結果。

1.3 人Kin17原核表達載體的構建和鑒定

引物設計與PCR：擴增人kin17 cDNA序列上游引物：上游 CGCGGATCCATGGGGAAGTCGGATT，酶切位點為BamHI；下游 CCGCTCGAGTCAGGCAAGTTTAG AAATG，酶切位點為XhoI。由上海生工合成。以法國 Angulo F.教授饋贈pCMV-kin17質粒為模板。反應條件按照PrimerSTARTM HS DNA Polymerase（Takara）說明書進行，具體為：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 1min，30 Cycles。按PCR片段純化試劑盒（上海生工）說明書將PCR擴增片段進行純化，取純化的Kin17 PCR擴增產物和pEGFP-N1質粒DNA進行BamHI和XhoI限制性內切酶酶切反應。再次純化酶切產物，利用T4 DNA連接酶進行DNA連接，16℃反應16h。將連接產物的轉化入感受態大腸桿菌DH10B。含氨芐青霉素（50mg/mL）的LB瓊脂平板上涂布菌液，37℃倒置培養12～16h，觀察到單菌落形成。挑取小部分菌落作為模板，再次進行相同PCR，將PCR反應電泳確證后的重組子克隆寄到上海生工測序。

1.4 質粒轉染MEFs

將18mm×18mm無菌蓋玻片置于6孔板中，接種1×106 MEFs細胞在蓋玻片上，過夜培養，次日轉染pEGFP-N1-kin17入MEFs。轉染試劑為Lipofectamine2000（Life），參考試劑說明書進行操作。配制A液：500?L OPTI Medium（Life）加入4?g質粒，B液為500?L OPTI Medium加入10?L Lipofatemine 2000。指尖輕彈管壁混勻，室溫靜置 5min。將 A 液和B液 相加并混勻，室溫靜置20min后，使用移液器輕輕滴加到培養MEFs的6孔板中，輕輕搖動 6孔板，混勻轉染混合液，將6孔板放回培養箱。轉染4～6h后更換新鮮培養基。

1.5 熒光顯微鏡觀察GFP-Kin17表達情況

轉染24h后PBS緩沖液洗MEFs 2次，4%PFA固定細胞10min，PBS緩沖液洗Hela細胞3次，10min/次。每個蓋玻片的細胞加約10?L SlowFade? Gold antifade reagent with DAPI 的封片劑，小心將蓋玻片放在載玻片上，四周封上少許透明指甲油。待樣品風干片刻，即可進行熒光顯微鏡觀測。也可將玻片暫存于-20℃或-80℃冰箱，觀測前取出即可。

2 結果

2.1 pEGFP-N1-kin17質粒的構建

pEGFP-N1載體全長為4700bp，人kin17全長為1182bp。人kin17的PCR產物兩端分別加上酶切位點和保護堿基，長度為1200bp。1%的瓊脂糖電泳可以看到pEGFP-N1-kin17 BamHI /XhoI雙酶切后的小片段DNA與PCR的DNA片段大小相同與預期片段大小一致，而pEGFP-N1-kin17單酶切的載體比單酶切空載體pEGFP-N1片段略長，同樣與預期片段一致。因此，瓊脂糖凝膠電泳證實pEGFP-N1-kin17成功構建，見圖1A。挑取經BamHI/XhoI雙酶切反應，凝膠電泳分離，證實成功構建的載體克隆，在1mL的LB培養液中過夜培養，送菌液樣品到上海生工生物有限公司測序。通過互聯網 www.ncbi.nlm.nih.gov，打開BLAST，輸入測序獲得的序列信息，進行序列比對分析，正向測序部分結果見圖1B。endprint

2.2 熒光顯微鏡觀察 kin17在MEFs中定位

MEFs是原代細胞，pEGFP-N1和pEGFP-N1-kin17分別轉染野生型和Zmpste24-/- MEFs，熒光顯微鏡觀察細胞，見圖2。其中，第1列為檢測綠色熒光獲得的圖像。在野生型和突變型兩種細胞中GFP空載體轉染均可見GFP蛋的表達。無論是在野生型還是突變型，GFP單獨轉染對照細胞中均可見GFP分布于整個細胞中，包括細胞核與細胞漿。而GFP偶聯Kin17的轉染的細胞中，GFP熒光信號則絕大部分在細胞核內呈均勻分散態，并在細胞核中出現較多密度較高的聚集。第2列為UV通道檢測DAPI染細胞核圖像，細胞核清晰可見，形態正常，均勻分布。第3列為第1和第2列圖像的疊加。

3 討論

Lmna基因通過不同的剪接過程表達lamin A/C蛋白（A型核纖層蛋白）。A型核纖層蛋白Lamin A/C與DNA的復制，轉錄，翻譯以及表觀遺傳學修飾等事件密切關聯[6]。關于kin17的研究發現并不多，目前認為，kin17與DNA復制起始點密切結合；與非復制起始點比較，kin17與復制起始點DNA的結合力強10倍。kin17通過與T抗原相互作用，結合于SV40的DNA復制起點。由此可見，kin17在DNA復制過程中與DNA復制起始關系更為密切。免疫電鏡也證實kin17與DNA復制相關蛋白質RPA，PCNA，和DNA聚合酶 α 等共定位[9-10]。可見，kin7與lamin A的關聯值得深入研究探討。我們通過Zmpste24-/-小鼠小鼠模型獲得Zmpste24基因缺失的MEFs，以此作為lamin A相關機制及早老癥相關機制研究的優先細胞模型。我們希望能在Zmpste24-/-小鼠中表達GFP-kin17以建立一個新的便于研究kin17和lamin A關系的細胞模型。

本實驗通過運用PCR法，從質粒中將人kin17 cDNA擴增，并將其成功插入pEGFP-N1載體中，經測序驗證，成功構建pEGFP-N1-kin17載體。同時，我們成功從孕13.5d Zmpste24+/-雌小鼠中獲得MEFs。并通過抽提基因組DNA進行運用PCR法進行基因型鑒定，其中E1，2，3，5為雜合子，E4為突變純合子，E6為野生型，見圖2A。隨后運用免疫印跡方法將E6和E4的MEFs在蛋白水平進行基因型鑒定，圖2B可見E4 中lamin A的蛋白條帶明顯比E6的高，表明分子量變大，提示該MEFs克隆的lamin A前體蛋白無Zmpste24剪切，仍以prelamin A形式存在，該結果與PCR法獲得的基因型鑒定結果是一致的。將MEFs種于6孔板后，通過脂質體轉染的方法，將pEGFP-N1空載體和pEGFP-N1-kin17載體導入野生型和Zmpste-/- MEFs活細胞內。熒光顯微鏡觀察到，GFP蛋白在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均為遍在表達，包括細胞漿和細胞核，提示GFP在MEFs中成功表達[11]。同時轉染了pEGFP-N1-kin17載體的野生型和Zmpste-/- MEFs細胞中，GFP標記的kin17只在細胞核內表達，這與其他實驗室在不同細胞株中的實驗結果一致[5]，提示本實驗成功構建pEGFP-N1-kin17載體，并能在野生型和Zmpste-/- MEFs細胞中成功表達GFP-kin17。此時Zmpste24-/- MEFs中GFP-kin17的定位并無異常。可見異常prelamin A堆積，對kin17 的核內定位未造成顯著影響，我們在鏡下未見kin17有定位異?；虺霈F明顯聚集體。是否這是因為本實驗選用的是第二代的年輕態的MEFs細胞，此時基因缺失MEFs和野生型MEFs表型差異不夠大 ？或者提示lamin A與kin17相互作用的功能關系，有可能是存在于某些信號傳導通路（或電離輻射或UV照射）產生的DNA損傷等其他特定應激事件中？兩者間的表達相互作用機制，還有待進一步借助Zmpste24-/-? MEFs模型開展深入研究。

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（收稿日期：2014-05-15）endprint

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