NBT自動(dòng)分析法測(cè)定D—3羥丁酸

牛慶慧　江月萍　王光蘭等

[摘要] 目的 建立簡(jiǎn)便和靈敏的雙試劑自動(dòng)化分析法測(cè)定血清D-3羥丁酸。 方法 在NAD和D-3羥丁酸脫氫酶存在下，用氯化硝基四氮唑蘭（NBT）作為顯色劑測(cè)定血清中的D-3羥丁酸。 結(jié)果 該法線性范圍為0～7.0mmol/L，平均回收率為98.7%，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于2%，與對(duì)照試劑盒比較有良好的相關(guān)性（r2 =0.996），具有良好的抗干擾能力。150例健康人血清D-3羥丁酸含量為0.03～0.30mmol/L。 結(jié)論 NBT自動(dòng)分析法測(cè)定D-3羥丁酸方法簡(jiǎn)便、靈敏可靠、適合臨床應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] D-3羥丁酸；血清；自動(dòng)分析法；NBT

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）13-115-03

[Abstract] Objective To establish a simple and sensitive automatic method for determination of D-3-hydroxybutyric acid in serum with two reagents. Methods With the existence of NAD and D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase， D-3-hydroxybutyric acid in serum was determined by NBT as a color-developing agent. Results The linearity range of the method was 0-7.0 mmol/L， average recovery rate was 98.7%， and both the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were less than 2%. There was a good correlation compared with the reference kit （r2=0.996）， and the capacity of resisting interference was good. The concentration of D-3-hydroxybutyric acid in the serum of 150 healthy people was 0.03-0.30 mmol/L. Conclusion The NBT automatic analysis method for determination of D-3-hydroxybutyric acid is simple， sensitive and reliable， which is appropriate to be applied clinically.

[Key words] D-3-hydroxybutyric acid； Serum； Automatic analysis method； NBT

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，酮癥及酮癥酸中毒是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥[1-2]，糖尿病酮癥酸中毒是指糖尿病患者在各種原因的作用下，胰島素不足，生糖激素異常升高，而導(dǎo)致的高血糖、高血酮、水電解質(zhì)酸堿失衡等。在肝臟中，脂肪酸氧化分解的中間產(chǎn)物乙酰乙酸、D-3羥丁酸及丙酮，三者統(tǒng)稱為酮體，其中D-3羥丁酸是酮體主要的成分，約占其總量的70%，因此臨床以檢測(cè)血清中D-3羥丁酸的濃度來反映體內(nèi)酮體的水平[3-4]。D-3羥丁酸檢測(cè)方法有氣相色譜法[5]、分光度法和酶法，酶法在準(zhǔn)確性、抗干擾能力和重復(fù)性等方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)[6]，但價(jià)格都比較昂貴。而國(guó)內(nèi)現(xiàn)有國(guó)產(chǎn)D-3羥丁酸試劑盒所用的顯色劑均為INT，還沒有使用NBT作為顯色劑的方法。我們首次報(bào)道以NBT作為顯色劑，雙試劑兩點(diǎn)終點(diǎn)法自動(dòng)化測(cè)定血清D-3羥丁酸的新方法。該法準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定，值得臨床推廣。

實(shí)驗(yàn)原理：采用酶化學(xué)比色法來測(cè)定血清中的D-3羥丁酸，先將血清中的D-3羥丁酸氧化為乙酰乙酸，同時(shí)將輔酶Ⅰ還原為還原型輔酶Ⅰ，還原型輔酶Ⅰ在黃遞酶的催化下將NBT生成紅色顯色物質(zhì)，在505nm處檢測(cè)吸光度的變化來計(jì)算血清中D-3羥丁酸的濃度。

D-3羥丁酸 +輔酶Ⅰ乙酰乙酸 +還原型輔Ⅰ

還原型輔酶Ⅰ+NBT formazane（紅色）

1 材料與方法

1.1 試劑

2 結(jié)果

2.1 靈敏度

將總濃度為1.0mmol/L的D-3羥丁酸用生理鹽水將做100倍稀釋，同時(shí)測(cè)定10次，分別計(jì)算出各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值；當(dāng)D-3羥丁酸的濃度為0.01mmol/L時(shí)，平均值-3標(biāo)準(zhǔn)差>3標(biāo)準(zhǔn)差。表明靈敏度可達(dá)0.01mmol/L。

2.2 線性范圍

使用生理鹽水對(duì)1份D-3羥丁酸濃度為8mmol/L的高值血清樣本進(jìn)行稀釋，分別是0.01、0.02、0.04、0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00mmol/L 10個(gè)不同濃度，各濃度均檢測(cè)5次， 進(jìn)行相關(guān)分析，以每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的吸光度值為y，對(duì)應(yīng)的理論濃度為x。發(fā)現(xiàn)在0.01～8.00mmol/L濃度梯度內(nèi)線性回歸方程為y=1.0023x + 0.0032，r2=0.996，表明該方法在此濃度范圍內(nèi)呈線性。

2.3 精密度

分別對(duì)RANDOX公司的低值和高值質(zhì)控以及1份患者隨機(jī)血清共3個(gè)樣本每天測(cè)定3次，檢測(cè)平均值和變異系數(shù)（CV值），連續(xù)測(cè)定20d。見表1。

2.4 方法對(duì)比試驗(yàn)

分別用德國(guó)Diasys公司D-3羥丁酸試劑盒（x）和本試驗(yàn)方法（y）對(duì)80份濃度范圍在0.01～8.00mmol/L的D-3羥丁酸臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，考察兩種方法的相關(guān)性，最終得到的結(jié)果為：y=0.975x+0.34，r2=0.995，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與德國(guó)Diasys公司的D-3羥丁酸試劑盒具有良好的相關(guān)性。

2.5 回收試驗(yàn)

用RANDOX的D-3羥丁酸濃度為0.5mmol/L標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行回收試驗(yàn)，來評(píng)價(jià)此方法的準(zhǔn)確性，分別加入0.124mmol/L、0.642 mmol/L、2.471mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，用來組成基礎(chǔ)樣本、回收樣本1和回收樣本2，回收率（%）=（回收樣本檢測(cè)值-基礎(chǔ)樣本檢測(cè)值）/加入的標(biāo)準(zhǔn)液濃度，最終計(jì)算回收率為96.2%～102.4%，平均回收率為98.7%，說明該方法具有不錯(cuò)的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2.6 干擾試驗(yàn)

取1份混合血清，分別配成不同濃度的膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白血清樣本，使用生理鹽水作對(duì)照，各個(gè)樣本均檢測(cè)10次，最終分析發(fā)現(xiàn)：三種常見的干擾物分別在100mg/dL、200mg/dL和200mg/dL時(shí)，對(duì)本試劑幾乎無干擾。

2.7 穩(wěn)定試驗(yàn)

加入防腐劑和穩(wěn)定劑后，放于37℃中保存10d穩(wěn)定性正常，測(cè)定結(jié)果沒有明顯變化，在4℃中能夠開口保存30d穩(wěn)定性正常。

2.8 正常參考范圍

選擇150名體檢合格成年人，男80名，女70名，年齡20～65歲?？崭轨o脈取血，用本法測(cè)的P2.5=0.03，P97.5=0.3因此得出正常人隨機(jī)血清D-3羥丁酸含量參考范圍是0.03～0.30mmol/L。

3 討論

近年來，我國(guó)糖尿病患病率逐漸增加，當(dāng)發(fā)生此病機(jī)體細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的氧化利用障礙，此時(shí)機(jī)體動(dòng)用體內(nèi)脂肪，通過脂肪分解供能，肝臟脂肪酸代謝旺盛，產(chǎn)生大量酮體，從而導(dǎo)致酮癥酸中毒的發(fā)生，所以及時(shí)準(zhǔn)確的診斷此癥的發(fā)生，對(duì)后續(xù)治療有較大的臨床意義。測(cè)定血液中D-3羥丁酸的濃度對(duì)糖尿病酮癥酸中毒的診斷有著重要意義。在酮癥酸中毒早期，尿酮水平無法測(cè)定時(shí)，血液中D-3羥丁酸即可測(cè)定。當(dāng)患者出現(xiàn)酮癥酸中毒的時(shí)候，血液中D-3羥丁酸濃度升高，此時(shí)檢測(cè)血液中D-3羥丁酸濃度可以有效的檢測(cè)患者的病情以及預(yù)測(cè)預(yù)后。目前國(guó)產(chǎn)試劑中均使用了INT作為顯色劑，這種試劑具有穩(wěn)定性差，使用不方便等方面的問題，故建立了一種新型的檢測(cè)D-3羥丁酸的方法非常有必要[10-12]。

試劑中我們對(duì)黃遞酶和D-3羥丁酸的濃度進(jìn)行了梯度分析，最終選擇現(xiàn)在的濃度，這樣既保證了反應(yīng)的線性和準(zhǔn)確性，又可以通過添加保護(hù)劑保證了酶的穩(wěn)定性，而且可以去除膽紅素、甘油三酯的干擾。通過回收試驗(yàn)和對(duì)比試驗(yàn)，試劑的準(zhǔn)確性較高。通過精密度試驗(yàn)，試劑的重復(fù)性較好。同時(shí)該方法的靈敏度為0.01mmol/L，該靈敏度完全能夠保證臨床檢測(cè)的需要。0.01～8.00mmol/L的檢測(cè)線性范圍，與國(guó)外的試劑相比，具有更寬的線性范圍，能夠保證高值樣本準(zhǔn)確的檢測(cè)。從穩(wěn)定性試驗(yàn)來看，該方法在該試劑在37℃和開口4℃中均能夠保證很好的穩(wěn)定性，解決了保存的問題，表明在方法的試劑在市場(chǎng)應(yīng)用中具有很好的前景。我們研究使用NBT作為顯色劑的D-3羥丁酸試劑盒相比現(xiàn)有的試劑盒擁有更好的線性范圍和穩(wěn)定性，而準(zhǔn)確性與國(guó)外的試劑盒比較也有很好的相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明選用NBT作為顯色劑的該檢測(cè)方法具有很好的前景，是一種適用于臨床的值得推廣的方法。

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（收稿日期：2014-04-24）