含鉀通道四聚化結構域15基因多態性與冠心病的關系及意義

劉長江 王小敏 于英 寧佳 張岳雯

·論著·

含鉀通道四聚化結構域15基因多態性與冠心病的關系及意義

劉長江 王小敏 于英 寧佳 張岳雯

目的 探討含鉀通道四聚化結構域15 (KCTD15)基因單核苷酸多態性(SNP)位點rs11084753與冠心病的遺傳易感性的關系。方法確診的冠心病患者426例(男216例，女210例)為病例組，非冠心病患者及正常體檢者436例(男224例，女212例)作為對照組，利用聚合酶鏈式反應( PCR) 分析技術及DNA直接測序技術，對2組EDTA抗凝血KCTD15基因 rs11084753(A/G)多態位點進行分型，按該位點等位基因A和G的出現情況將基因型分為AA、AG、GG三種類型。采用因素回歸分析統計該多態位點與冠心病易感性的關系。檢測所有研究對象的血脂水平。結果病例組血脂指標中TC、TG、LDL-C與對照組比較明顯升高，而HDL-C則明顯低于對照組；病例組患者吸煙、飲酒及陽性家族史的比例均高于對照組(P均<0.05)。AA、AG、GG基因型在病例組中的分布頻率分別為52.4%、32.6%和15.0%，在對照組中分別是76.1%、18.4%和5.5%，2組基因型頻率分布差異有統計學意義(χ2=8.174，P=0.0098)。多因素分析顯示，攜帶rs11084753(A/G)多態位點G變異等位基因與冠心病的遺傳易感性有明顯相關關系(OR=5.94， 95%CI=3.02～22.31，P<0.01) 。結論KCTD15基因 rs11084753(A/G)多態位點與河北地區漢族人冠心病遺傳易感有關。

含鉀通道四聚化結構域15基因；單核苷酸多態性；冠心病；遺傳易感性

冠心病是嚴重威脅人類生命的主要心血管系統疾病,其病因是冠狀動脈粥樣硬化改變導致血管腔栓塞[1]。近年來動脈粥樣硬化性疾病在發展中國家和發達國家的發病率和死亡率都不斷升高，已成為主要死亡原因之一。在我國冠心病的危害也日趨嚴重，已成為研究者的關注熱點。學者們從遺傳因素、環境因素等多方面對冠心病危險因素和發病機制等方面進行研究，認為遺傳因素在冠心病的發生與發展過程中的重要作用[2,3]，但具體的情況還不明確。近年來有研究發現含鉀通道四聚化結構域15 (potassium channel tetramerization domain containing 15，KCTD15)基因與肥胖、糖耐量異常等代謝異常性疾病有關[4,5]，而肥胖是冠心病發病的重要危險因素[6]，而KCTD15基因是否與冠心病有關報道尚不多見。因此本研究通過檢測河北局部地區漢族患者冠心病患者血液KCTD15基因的SNP位點rs11084753多態性的關系，分析了KCTD15基因與冠心病的發生發展的相關性，為揭示冠心病的發病機制并更好的對該病進行預防提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年3月至2013年9月在我院治療，經冠狀動脈造影、冠脈CTA等檢查確診為冠心病的住院患者，共426例。冠心病診斷標準參照國際心臟病學會及WHO臨床命名《缺血性心臟病的命名及診斷標準》，影像學檢查顯示主要動脈中至少有1支內徑狹窄>50%。病例組中男216例，女210例；年齡44～69歲，平均年齡(53±9)歲。對照組為同期于我院住院的患者及健康體檢者共436例，均排除患冠心病。對照組中男224例，女212例；年齡42～67歲，平均年齡(52±11)歲。所有冠心病患者和正常對照個體均無血緣關系，所有納入對象如有感染、腫瘤、嚴重肝腎疾病、心肌炎、糖尿病、先心病、心肌病、自身免疫性疾病、心肌炎、嚴重創傷等疾病均排除。所有標本均收集年齡、性別比、吸煙史、飲酒史、收縮壓和舒張壓、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、冠心病家族史等資料。所有入選個體均為河北地區出生并長期居住，均為漢族，自愿簽署知情同意書,并得到了河北省唐山市樂亭縣醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 試劑與儀器 TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒(TianGen)，Taq DNA 聚合酶和DL500TM DNA Marker(Takara公司)，Mastercycler R gradient PCR儀(Eppendorf公司)，ABI PRISM 377 DNA 測序電泳儀(ABI公司) 。

1.3 血液標本收集 所有受試對象均無影響脂類代謝的疾病，未用影響糖脂代謝藥物。所有研究對象空腹12 h，次日清晨抽取靜脈血，取4 ml置于EDTA抗凝管中，用于提取DNA；另取4 ml，分離血清，進行血脂指標檢測。

1.4 基因多態性檢測(直接測序法)

1.4.1 基因組DNA提取：EDTA-K2抗凝血400 μl按照天根血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書提取基因組DNA。-80℃保存備用。

1.4.2 PCR擴增KCTD15基因片段：引物設計采用生物學軟件Primer 5.0，并與GenBank進行比對。引物序列為上游5＇-GAACAACCCAAATCCCCATC-3＇，下游5＇-ACAGGCACCCACCACCAC-3＇。PCR反應體系：共20 μl，包括：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，KOD plus 0.5 μl，Buffer 2 μl，dNTP Mixture 1 μl，雙蒸水13.5 μl。PCR反應采用聚合酶鏈反應技術，反應條件見參考文獻[7]。所得產物進行特異性檢驗。

1.4.3 核苷酸序列分析：將PCR擴增產物純化后直接測序。為保證測序結果的可靠性，均雙向測序。測定結果用DNAMAN軟件(V6.0.3.99漢化版)與GenBank公布的KCTD15基因序列進行比對。

2 結果

2.1 2組一般情況比較 2組年齡、血壓無明顯差異(P>0.05)；而病例組血脂指標中TC、TG、LDL-C與對照組比較明顯升高，而HDL-C則明顯低于對照組(P均<0.05)。冠心病組吸煙、飲酒及陽性家族史的比例均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

一般情況病例組(n=426)對照組(n=436)t(χ2)值P值年齡(年)53±952±111．3410．180SBP(mmHg)121±27117±281．8500．065DBP(mmHg)78±1077±131．5580．120TC(mmol/L)5．5±1．3?4．9±1．17．321<0．001TG(mmol/L)2．5±1．0?2．0±1．06．685<0．001HDL?C(mmol/L)1．1±0．8?1．4±0．9-5．286<0．001LDL?C(mmol/L)3．2±1．1?2．5±1．08．815<0．001BMI(kg/m2)27．4±2．5?24．4±2．119．183<0．001吸煙[例(%)]115(27．0)?55(12．6)28．145<0．001飲酒[例(%)]154(36．2)?96(22．0)20．898<0．001家族史[例(%)]109(25．6)?74(17．0)9．5620．002

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 KCTD15基因 rs11084753位點多態性分析結果 PCR產物純化后送往北京三博遠志公司進行直接雙向測序。測序結果發現該位點存在等位基因A和G，基因型分為AA、AG、GG三種類型。見圖1。

圖1 KCTD15基因 rs11084753位點多態性分析的測序結果

2.3 KCTD15基因 rs11084753位點基因多態性分析結果 KCTD15基因 rs11084753位點等位基因G在冠心病組頻率為0.3134，明顯高于在對照組的頻率0.1468。冠心病組GG及AG基因型明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 KCTD15基因 rs11084753位點基因型和等位基因頻率在冠心病組及正常組分布情況 例(%)

注：與對照組比較,*P<0.05

2.4 KCTD15基因rs11084753位點突變與冠心病的關系 KCTD15基因 rs11084753位點與冠心病有相關關系。與A/G基因型、A/A基因型相比，G/G基因型能顯著性的增加冠心病的風險。OR(95%CI)值為5.33(2.62～19.77)，調整了性別、年齡、吸煙史、飲酒史、收縮壓和舒張壓、TC、TG、HDL-C之后為5.94(3.02～22.31)。見表3。

表3 KCTD15基因 rs11084753位點與冠心病的相關關系

3 討論

近年來，雖然冠心病得到了世界范圍內學者和醫務工作者的重視，但冠心病的發病率和死亡率在發達國家和發展中國家仍呈現快速上升趨勢，危害性不斷增高。冠心病的發生是多種因素共同作用導致的，與遺傳、不良生活習慣、血脂異常等因素有關[8,9]。本研究也發現，與對照組比較，冠心病患者吸煙、飲酒的比例更高，血脂指標TC、TG、LDL-C與對照組比較明顯升高，而HDL-C則明顯低于對照組。同時本研究也發現，冠心病患者的家族史比例更高，這說明遺傳因素與冠心病發病密切相關。這與其他研究者的結論一致[10]。在冠心病遺傳因素的研究中，關于基因多態性的研究是目前的熱點。本研究在此方面做了一定的工作。本研究雖為本院的單中心研究，但所納入的研究對象樣本量較大，且均為漢族人。由于河北省漢族人群較為穩定，故我們認為本研究對于探討河北省漢族人群基因多態性與冠心病的關系有較好的代表性。

KCTD15基因位于19q13.11，編碼含鉀通道四聚化結構域 15。KCTD15基因在腦及下丘腦影響食欲及能量平衡區域高表達，是一個調節能量平衡與能量動態平衡的重要信號分子，可能通過神經中樞影響肥胖狀態[5]，是導致肥胖的重要候選基因。對大量樣本進行全基因組關聯研究(GWAS)分析篩選后也發現KCTD15與體重指數(BMI)相關，是肥胖的危險因素[11]。從而在控制飲食和體重穩態中起關鍵作用。但到目前為止有關KCTD15基因多態性與冠心病之間的研究報道還很少見。因此本研究檢測了該基因rs11084753位點多態性的情況，結果發現KCTD15基因rs11084753位點突變與冠心病有密切的關系。

本研究選取了性別年齡相匹配的病例組和對照組，結果顯示對照組rs11084753位點AA/AG/GG基因型分別占76.1%、18.4%、5.5%，病例組AA/AG/GG基因型分別占52.4%、32.6%、15%，病例組的GG及AG基因型明顯高于正常組，2組之間存在明顯的統計學差異，同時病例組等位基因G的頻率為0.3134，明顯高于在對照組的頻率0.1468。KCTD15基因rs11084753位點G/G基因型引發冠心病的危險性OR(95%CI)值 為5.33(2.62～19.77)，調整了性別、年齡、吸煙史、飲酒史、收縮壓和舒張壓、TC、TG、HDL-C之后為5.94(3.02～22.31)，明顯高于AA/AG基因型，因此證明KCTD15基因rs11084753位點突變是導致冠心病發病的獨立危險因素。

本研究證實KCTD15基因的SNP位點rs11084753突變與冠心病的發生關系密切，可能是導致冠心病的重要危險因素，因此對于存在冠心病家族史的人群應進行該基因突變性的檢測。但本研究還處于初始階段，有關KCTD15基因rs11084753位點突變后導致冠心病的具體機制尚待進一步研究。

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SignificanceKCTD15genepolymorphismanditscorrelationwithgeneticsusceptibilitytocoronaryheartdisease

LIUChangjiang,WANGXiaomin,YUYing,etal.DepartmentofCardiology,People’sHospitalofLaotingCounty,Hebei,Laoting063600,China

ObjectiveTo explore the significance of rs11084753 site polymorphism of potassium channel tetramerization domain containing 15 (KCTD15) gene and its relationship with genetic susceptibility to coronary heart disease (CHD).MethodsThe 426 patients with CHD including 216 males and 210 females were enrolled as case group,and the other 436 healthy subjects were enrolled as control group.The rs11084753 site polymorphism of KCTD15 was detected by PCR-RFLP and DNA sequencing technology.All the tested subjects were divided into 3 groups (AA,AG,GG) according to the genotypes of rs11084753 site.The levels of serum lipids in both groups were detected simultaneously.The stepwise multiple linear regression analysis was used to analyze the correlation between rs11084753 site polymorphism of KCTD15 gene and genetic susceptibility to coronary heart disease.ResultsAs compared with those in control group,the serum levels of TC,TG,LDL-C were significantly increased in case group,however,the levels of HDL-C were obviously decreased (P<0.05).The proportion of smoking,drinking,family history in case group was significantly higher than that of control group (P<0.05).The distribution frequency of AA,AG,GG genotypes in case group was 52.4%,32.6%,15.0%,respectively,however,which was 76.1%,18.4%,5.5%,respectively in control group,there was a significant difference between two groups (P<0.01).The stepwise multiple linear regression analysis showed that genotype A/G of rs11084753 site was related to genetic susceptibility to CHD (OR=5.94,95%CI=3.02,P<0.01).ConclusionThe rs11084753 site polymorphism (A/G) of KCTD15 gene is related to genetic susceptibility to CHD of Han people in Hebei province.

potassium channel tetramerization domain containing 15 (KCTD15) gene;single nucleotide polymorphisms;coronary heart disease;genetic susceptibility

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.03.002

063600 河北省樂亭縣醫院內二科(劉長江、王小敏、于英、張岳雯)，藥劑科(寧佳)

R 541.4

A

1002-7386(2014)03-0327-04

2013-10-27)