原發性小腸腺癌中PTEN蛋白及PCNA的表達及臨床意義

吳曉華 張莘 周文闊

·論著·

原發性小腸腺癌中PTEN蛋白及PCNA的表達及臨床意義

吳曉華 張莘 周文闊

目的 檢測PTEN蛋白和PCNA在原發性小腸腺癌組織、癌旁組織及正常小腸組織中的表達，探討其與原發性小腸腺癌的關系，為原發性小腸腺癌預后判斷提供依據。方法采用SP免疫組化法對32例小腸腺癌及其相應癌旁組織、8例正常小腸組織進行PTEN蛋白及PCNA的定位觀察。結果原發性小腸腺癌組織中PTEN蛋白陽性率為71.88%(23/32),相應癌旁組織及正常小腸組織中PTEN蛋白未陽性率分別為15.63%(5/32)、2.50%(1/40)，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)；原發性小腸腺癌組織中PTEN蛋白的表達與其分化程度及有無淋巴結轉移相關(P<0.05)。原發性小腸腺癌組織中PCNA陽性率為65.63%(21/32),相應癌旁組織6.25%(2/32)及正常組織PCNA陽性率為2.50%(1/40)，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)；原發性小腸腺癌組織中PCNA的表達與腫瘤部位、浸潤深度、分化程度相關(P<0.05)。結論小腸腺癌中PTEN蛋白和PCNA的高表達可作為判斷預后的有效指標，兩者聯合檢測可早期診斷小腸腺癌并判斷預后。

腺癌，小腸；免疫組織化學 ；PTEN；增殖細胞核抗原；預后

PTEN抑癌基因對腫瘤的發生、發展起到重要作用，與腫瘤的侵襲和預后緊密相關，內源性增殖細胞的標記物增殖細胞核抗原(PCNA)的表達水平與腫瘤增殖有關。本研究采用免疫組織化學技術，探討抑癌基因PTEN蛋白和PCNA在原發性小腸腺癌中的表達及其與原發性小腸腺癌發生、發展及臨床預后性指標的關系，為判斷預后提供參考指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本取自我院普通外科2004年4月至2007年10月手術切除的原發性小腸腺癌32例，術前均未行放、化療，男13例，女19例；年齡32～82歲，平均55.6歲。病變位于十二指腸22例，空腸4例，回腸6例；按小腸腺癌病理分化程度不同分高分化組9例、中分化組14例、低分化組9例。按淋巴結有無轉移分淋巴結轉移20例、無轉移12例。癌組織和癌旁組織分別制作病理切片3張，1張行HE染色重新病理確診，2張分別行PTEN和PCNA的免疫組化染色。取8例正常小腸組織蠟塊作為對照。均有完整隨訪資料。

1.2 試劑 鼠抗人PTEN單克隆抗體、鼠抗人增殖細胞核抗原單克隆抗體分別購自北京中山生物技術有限公司和上海瑞齊生物科技有限公司，ABC藥盒及試劑購自華美生物工程公司。

1.3 免疫組織化學染色 所有標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，厚4 μm。參照ABC法進行免疫組化染色。PTEN陽性對照選用已知的乳腺癌標本，PCNA陽性對照選用食管鱗癌標本。陰性對照以PBS替代一抗。

1.4 結果判斷 免疫組織化學染色結果采用半定量計數方法，由兩位病理科高年資醫師隨機選取10個高倍視野進行評判，PTEN蛋白和PCNA的陽性結果為細胞核棕褐色顆粒，具體計分方法為IRS=染色強度(SI)×陽性細胞百分比(PP)。SI分4個等級，0為陰性，1弱陽性，2中度陽性，3強陽性；PP分5個等級，0級為無陽性染色，1級為 10%，2級為10%～50%，3級為51%～80%，4級為80%以上。IRS結果在0～12分，積分在2分以上為陽性。

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件包進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，生存曲線用Log-rank test，預后多因素分析應用Cox風險比例模型進行分析。

2 結果

2.1 PTEN蛋白和PCNA的表達 PTEN蛋白免疫組化染色陽性產物主要存在于細胞核，呈棕黃色或深褐色顆粒。32例小腸腺癌組織中PTEN 蛋白表達陽性率為71.88%(23/32)，對照切片陰性。癌旁組織及正常小腸組織分別為15.63%(5/32)、5.00%(2/40)。2組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。PCNA表達陽性率為65.63%(21/32)，癌旁組織及正常小腸組織分別為6.25%(2/32)、2.50%(1/40)，2組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。低分化組PTEN 蛋白表達陽性66.7%(6/9),中分化組85.71%(12/14)及高分化組88.89%(8/9)，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),而在不同性別、腫瘤大小、浸潤深度差異無統計學意義(P>0.05) ，淋巴結轉移組的PTEN 蛋白表達80.00%(16/20)低于淋巴結無轉移組91.67%(11/12),但差異無統計學意義(P>0.05)。表明PTEN基因的缺失導致PTEN 蛋白降低，致使小腸腺癌細胞的生長、分裂不受控制，脫離了正常生長調控狀態，癌細胞呈無節制的生長。小腸腺癌分化程度越低，PTEN蛋白表達越低，腫瘤的惡性度越高。PCNA表達陽性率為65.63%(21/32)，癌旁組織及正常小腸組織分別為6.25%(2/32)、2.50%(1/40)，2組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。低分化組PCNA表達陽性率88.89%(8/9),中分化組71.43%(10/14),高分化組55.56%(5/9)，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),而在不同性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度差異無統計學意義(P>0.05)，淋巴結轉移組的PCNA表達(15/20，75.00%)高于淋巴結無轉移組(7/12，58.33%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 小腸腺癌組織、癌旁組織及正常小腸組織PTEN蛋白和PCNA的表達比較 例(%)

表2 小腸腺癌組織PTEN蛋白和PCNA的表達影響因素分析 例(%)

2.2 PCNA和PTEN蛋白聯合表達情況與臨床病理學指標和預后的關系 將小腸腺癌組織PCNA和PTEN蛋白表達結果進行組合，PCNA (-)/PTEN (+)組多見于腫瘤中早期腫瘤(63.17 %，12/19)，PCNA(+)/PTEN(-)組多見于晚期腫瘤(71.43%，5/7)，且PCNA (-)/PTEN (+)組以無淋巴結轉移為主(66.67%，10/15)，而PCNA(+)/PTEN(-)組以有淋巴結轉移為主(71.43%，5/7)。PCNA (-)/PTEN (+)組5年生存率最高達70.6%，與其他各組兩兩比較差異有統計學意義(P<0 01)，而PTEN蛋白陽性組及陰性組5年生存率比較差異無統計學意義 (P<0.05)。表明聯合檢測PCNA和PTEN蛋白可進一步明確小腸腺癌分期及判斷預后。

2.3 其他 將影響小腸腺癌患者預后的各種因素(性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、PCNA表達、PTEN蛋白表達及4組不同PCNA和PTEN蛋白聯合表達情況)經Cox風險比例模型分析，結果顯示影響小腸腺癌預后的因素主要為淋巴結有否轉移及PCNA /PTEN聯合表達情況(P<0. 01)，無淋巴結轉移(P<0. 01)和PCNA (-)/PTEN (+)(P<0. 01)預后較好，而其他指標均未顯示出統計學意義(P>0.05)。

3 討論

小腸約占胃腸道全長的75%，其黏膜總面積約占胃腸道表面積90%以上，但小腸腫瘤發病率低，約占胃腸道腫瘤的5%左右，惡性腫瘤發病率約占胃腸道惡性腫瘤的2%左右[1]。以腺癌及類癌最為常見，約占小腸惡性腫瘤的55%～80%。研究抑癌基因與PCNA對小腸腫瘤的發生、發展及預后的影響的文章較多，但對抑癌基因PTEN和PCNA在小腸腺癌中的表達的研究國內尚未見報道，我們應用免疫組化方法檢測PTEN蛋白及PCNA，從分子水平探討小腸腺癌發生、發展的原因，尋找早期診斷小腸腺癌的方法，尋找判斷小腸腺癌預后的主要因素。PTEN是1997年發現的一個新抑癌基因[2]， PTEN蛋白含有一酪蛋白磷酸酶的功能區和約175個氨基酸與張力蛋白和輔助蛋白同源的區域。PTEN決定性的負性調節作用普遍存在于P13K信號通路中，從而發揮轉換和調節生長、繁殖及存活信號[3]。許多癌基因的產物都是通過磷酸化而刺激細胞生長，PTEN基因通過其脂質磷酸化酶活性使P IP3 去磷酸化，促進細胞凋亡，阻止不受控制的細胞生長，參與細胞調控，從而限制腫瘤的形成。本研究中，PTEN蛋白表達陽性率為71.88%(23/32)，PTEN蛋白表達與小腸癌組織分化程度呈正相關 (P<0.05)， 而與患者性別、年齡、腫瘤臨床分期、淋巴結轉移與否和5年生存率無關(P>0.05) ，提示由于抑癌基因PTEN基因缺失，導致PTEN蛋白的丟失，從而使得小腸癌細胞原有的正常生長調控狀態發生紊亂，促使腫瘤細胞無節制的生長， PTEN蛋白越少，小腸腺癌細胞的分化程度就越低，其惡性度越高。檢測小腸腺癌組織抑癌基因PTEN蛋白的表達，有助于早期診斷小腸腺癌，并對小腸腺癌預后進行更準確的評估。

PCNA于1978年首次發現，是一種相對分子質量為3.6×104的酸性核蛋白，共261 個氨基酸，其中酸性氨基酸明顯多于堿性氨基酸[4]。PCNA在DNA 鏈的損傷、修復、復制等環節中起關鍵作用，能夠加快DNA的合成速度。PCNA在細胞周期G2、M期最少，從G1 期開始合成，逐漸增加，S 期達到高峰[5]，其量的變化與和DNA 合成一致。PCNA 陽性表達的強弱直接反映了細胞增殖活動的高低，是評價細胞增殖狀態的良好指標，由于腫瘤細胞普遍具有旺盛的增殖能力，所以在許多腫瘤研究中顯示PCNA與腫瘤的發生、發展、惡性程度、分期及預后有關。大量研究表明，PCNA可作為組織癌變的一個標記物，亦可作為臨床判斷腫瘤惡性程度的指標[6]，PCNA高表達也是腫瘤預后不良的標志。本研究中，PCNA在癌組織、癌旁及正常小腸組織中的表達表現為遞減，在低分化組、中分化組及高分化組中遞減。淋巴結轉移組(75.00%)高于無淋巴結轉移組(58.33%)，差異有統計學意義(P<0.05)，本研究結果提示，PCNA表達越強，小腸腺癌細胞的增殖越不受控制，導致小腸腺癌的分化越差，淋巴結越易發生轉移，預后不良， PCNA可作為判斷小腸腺癌惡性程度及預后的有效指標。在本研究中PCNA (-)/PTEN (+)組5年生存率最高達70.6%，明顯優于單獨檢測PCNA和PTEN蛋白對預后的判斷。

綜上所述，小腸腺癌組織中PTEN蛋白表達與PCNA表達一致，但在小腸腺癌分化程度上表達相反，抑癌基因PTEN基因的缺失導致PTEN蛋白減少，促使小腸腺癌細胞的正常生長調控狀態出現紊亂并產生腫瘤細胞無節制的生長， PTEN蛋白表達越減少，腫瘤 細胞的分化程度就越低，腫瘤的惡性度越高；而小腸腺癌分化越差，細胞凋亡減少，細胞增殖活動明顯增強，所以PCNA表達越強，小腸腺癌的分化越差，越易發生淋巴結轉移。我們推測抑癌基因PTEN的缺失及PCNA增多協同作用導致小腸腺癌惡性程度增高，預后不良，所以聯合檢測PTEN蛋白、PCNA可作為判斷腫瘤分級及預后的重要參考指標。

1 Bruecher BL,Roder JD,Fink U,et al. Prognostic factors in resected primary small bowel tumors.Dig Surg,1998,15: 42-51.

2 Li j,Yen C,Liaw D,et al.PTEN a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain and prostate cancer. Science,1997,275:1943-1947.

3 Vivanco I,Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-kinase-AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer,2002，2：489-501.

4 Zhou BR,Liu WL,Luo D.Protective effect of baicalin against multiple ultraviolet B exposure-mediated injuries in C57BL/6 mouse skin. Arch Pharm Res,2011,34:261-268.

5 Zheng L,Dai H,Hegde ML,et al.Fen1 mutations that specifically disrupt its interaction with PCNA cause aneuploidy-associated cancer.Cell Res，2011，21：1052-1067.

6 Chen YC,Ren F,Sang JR,et al.Type II Cgmp-dependent protein kinase inhibits proliferation of the gastric cell line BGC-823.Mol Med Report，2010,3:361-366.

ExpressionofPTENproteinandPCNAinprimarysmallboweladenocarcinomaandSignificancy

WUXiaohua，ZHANGShen，ZHOUWenkuo.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstHospitalofQinhuangdao,Hebei,Qinhuangdao066000,China

adenearcinoma intestine，small；protein PTEN；proliferating cell nuclear antigen；immunohistochemistry;prediction

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.03.003

060000 河北省秦皇島市第一醫院普通外科

R 735.3

A

1002-7386(2014)03-0330-03

2013-09-11)

AbstrctObjectiveTo detect PTEN protein and proliferatingcell nuclear antigen(PCNA)in primary small bowel adencareinoma(SBAC) tissue，adjacent nontumorons tissue,and normal small bowel tissue,to investigate the relationship between the expression of tumor suppressor gene PTEN protein and PCNA and the biologcal behaviors of primary small bowel adencareinoma.MethodsExpression of PTEN protein and PCNA location were examined by streptavidin-peroxidase immunohistochemistry method in 32 SBAC，the corresponding adjacent nontumorons tissue and 8 normal small bowel tissues.ResultsExpression of PTEN protein was detected in 71.88% of the primary SBAC tissue，while expression in adjacent nontumorous tissue and normal small bowel tissue was detected in 15.63% and 12.50% (P<0.05)．The positive expression of PTEN was significantly related to the cell differentiation，diversion of ganglia lymphatica in primary SBAC tissue(P<0.05).Expression of PCNA was detected in 65.63% of the primary SBAC tissue. 6.25% of the adjacent nontumor tissue and 2.50% normal small bowel tissue(P<0.05)；The positive expression 0f PCNA was a significantly related to the tumor location，tumor infiltration depth and cell differentiation in primary SBAC tissue(P<0.05).ConclusionExpression of tumor suppressor gene PTEN and PCNA could be helpful in predicting the biological behavior and prognosis of primary SBAC．