烏梅丸對小鼠乳腺癌增殖轉移及Fas、FasL分子表達的影響*

★ 王萍 楊海燕 施旻

(江西中醫藥大學 江西 南昌 330004)

在不能徹底治愈大多數惡性腫瘤的背景下，抑制惡性腫瘤的轉移是防治腫瘤的關鍵因素。中醫藥在扶正祛邪的原則指導下，對改善腫瘤患者生存質量和延長生存期等方面具有一定的優勢[1]。目前中醫對惡性腫瘤轉移的病因病機認識還不是很完善，我們在此基礎上提出了厥陰風動的病機是惡性腫瘤轉移的可能機制，以此解釋惡性腫瘤的病因——“痰”、“瘀”“毒”等流竄至其他部位的過程。而烏梅丸作為厥陰病的主方，以烏梅為君藥，具有收斂肝風的作用，全方兼有清熱燥濕解毒、益氣溫陽等作用[2]。本研究以小鼠乳腺癌轉移模型為對象，觀察烏梅丸對腫瘤轉移的影響，探討厥陰風動病機在腫瘤轉移中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物 SPF級BALB/c小鼠，20±2g，雌性，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2011-0003。

1.2 藥物與試劑 烏梅丸方(烏梅20g、細辛3g、干姜6g、桂枝6g、淡附片6g、蜀椒4g、黃連3g、黨參10g、當歸10g、黃柏6g)各組成藥物采用配方顆粒劑，由廣東一方制藥有限公司生產。臨用前按說明將顆粒劑倒入容器中，加開水溶解，冷卻后備用，制成1g/mL生藥濃度藥液。

FAS antibody、FAS-L antibody、兩步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細胞株 小鼠乳腺癌4T1細胞株由江西中醫藥大學教育部重點實驗室劉波老師惠贈，購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

1.4 方法

1.4.1 乳腺癌細胞培養與接種造模 乳腺癌4T1細胞經常規培養后，收集生長狀態良好的細胞，以無血清RPMI1640培養液調整為1×107個/mL濃度細胞懸液。于BALB/c小鼠第4對乳腺右側乳墊下接種細胞液0.1mL。1周后觀察接種處腫瘤生長情況，增殖為綠豆大小的腫瘤即造模成功。

1.4.2 動物分組與用藥 選擇腫瘤大小一致的小鼠隨機分為4組，其中藥物組3組，模型對照組1組。藥物組分別為烏梅丸全方組(簡稱烏梅丸組)、烏梅丸去烏梅組(簡稱去烏梅組)及烏梅單味藥組(簡稱烏梅組)。根據小鼠體重，以人臨床用藥折算量進行藥物干預1個月。

1.4.3 一般情況觀察 每天觀察各組小鼠的取食情況、精神狀態、毛發整齊與光澤度及死亡情況。

1.4.4 腫瘤生長曲線 每隔4天用游標卡尺測量乳腺癌接種處腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，瘤體積=0.5×長徑×短徑×短徑。取各組平均體積，繪制生長曲線。

1.4.5 抑瘤率 藥物干預結束后稱量小鼠體重，并剝離接種處腫瘤，稱取瘤重。抑瘤率IR(%)=(1-藥物組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.4.6 腫瘤轉移觀察 剝離接種處腫瘤后，肉眼探查其他部位可見腫瘤情況。暴露胸腔，完整分離肺臟后，置于Bouin's液中固定24h，無水乙醇脫色，觀察肺部轉移灶情況。

1.4.7 瘤組織Fas與FasL分子的表達 剝離后的腫瘤塊立即置于4%中性甲醛中固定24h，經常規程序制作成石蠟組織切片。采用兩步法免疫組化方法觀察瘤組織Fas和FasL分子的表達情況，用圖像分析儀進行圖像采集。

1.4.8 統計學方法 采用IBM SPSS 19.0分析軟件，多組均數比較采用應用單因素方差分析(One-Way ANOVA)的LSD檢驗進行統計處理。

2 結果

2.1 一般情況 荷瘤小鼠至20天左右，烏梅丸組各小鼠活動狀態好，毛發整齊有光澤，其余三組活動狀態欠佳，毛發亂而少光澤。至26天后去烏梅組、模型對照組各死亡1只，至28天烏梅組死亡1只。

2.2 腫瘤生長曲線 各組乳腺癌接種原位瘤的體積如表1、圖1所示：腫瘤的增殖趨勢在各組間一致，隨著時間的推移，腫瘤體積不斷的增長；實驗最后一次測量時間點表明，各藥物組的平均瘤體積較模型對照組小，但只有烏梅組與模型對照組比較有統計學差異(P=0.041)；藥物各組間腫瘤體積差異不明顯。

表1 乳腺癌接種原位瘤平均體積(mm3)

圖1 乳腺癌接種原位瘤生長曲線

2.3 抑瘤率 各組的接種原位瘤經剝離后稱重，如表2所示：各藥物組的平均瘤重均比模型對照組輕，但只有烏梅組與模型對照組比較有統計學差異(P=0.019)；各藥物組間，烏梅組較去烏梅組瘤體積更小，有統計學差異(P=0.048)。烏梅組、烏梅丸組、去烏梅組的抑瘤率呈下降趨勢。

表2 各組的瘤重及抑瘤率情況

2.4 腫瘤轉移情況 如表3結果所示：烏梅丸組除有1例出現胸腔積血外，其余胸腔部清晰，肺部無明顯肉眼可見轉移瘤；去烏梅組有3例出現胸腔積血，肺部不清，有肉眼明顯可見轉移瘤，有1例出現腹部皮下綠豆大轉移瘤，1例出現頸部2處黃豆大轉移瘤灶；烏梅組有2例出現胸腔積血，肺部不清，有肉眼明顯可見轉移瘤，有1例出現右上肢腋下5mm×5mm腫瘤灶，1例出現膈肌轉移灶；模型對照組有3例出現胸腔積血，肺部不清，有肉眼明顯可見轉移瘤，1例出現肋間轉移灶。

Bouin's液固定肺部后，計算肺表面轉移灶數，結果如表3和圖2，各藥物組的轉移灶數均較模型對照組少，其中烏梅丸組與模型對照組比較有統計學差異。

表3 各組乳腺癌轉移情況

1-烏梅丸組；2-去烏梅組；3-烏梅組；4-模型對照組

2.5 瘤組織Fas與FasL分子的表達 如圖3、圖4所示，乳腺癌細胞胞漿中的棕黃色顆粒即為Fas或FasL分子。烏梅丸組、去烏梅組和烏梅組的Fas表達均較模型對照組多；而FasL分子則是模型對照組表達更明顯。

A-烏梅丸組；B-去烏梅組；C-烏梅組；D-模型對照組

3 討論

烏梅丸是厥陰病的主方，主要用于蛔厥證，具有溫臟安蛔蟲、寒熱并用、邪正兼顧的功效。后世醫家根據烏梅丸組方不斷擴大其應用范圍[3]，其中烏梅丸也應用于惡性腫瘤相關病證的治療[4,5]。本研究依據厥陰風動病機可能與惡性腫瘤的轉移相關的假設，探討了烏梅丸對小鼠乳腺癌生長和轉移的影響，并通過拆方研究同步探究了烏梅丸中酸斂熄風的主藥烏梅的作用。研究結果表明，烏梅丸及各拆方組均可以一定程度抑制小鼠乳腺癌的增殖和轉移。

Fas與FasL是腫瘤細胞免疫中的重要分子。殺傷性淋巴細胞表達的FasL分子與腫瘤細胞表面的Fas分子結合，可以誘導腫瘤細胞的凋亡。但惡性腫瘤發展過程中，腫瘤細胞常改變自身的分子表達情況，從而逃避免疫細胞的識別殺傷，即腫瘤的免疫逃逸機制。其中惡性腫瘤細胞常調低自身Fas分子的表達而避免淋巴細胞的殺傷，另外也可以高表達FasL分子與高表達Fas分子的淋巴細胞結合導致后者的凋亡。這些免疫逃逸機制促使了惡性腫瘤細胞的存活，有利于其增殖轉移[6]。本研究結果也初步顯示了烏梅丸各組可以上調乳腺癌細胞Fas分子的表達，下調FasL分子的表達。這些機制可能與烏梅丸各組抑制乳腺癌的增殖和轉移有關。

但拆方研究結果還沒有明顯的證據表明烏梅在全方抑制乳腺癌增殖和轉移中的作用。烏梅丸中包含有扶正的附子、黨參、當歸等藥物，也包含祛邪的黃連、黃柏等藥物，全方的抑制腫瘤的作用是否與這些藥物相關還得進行深入的探討。

[1]王錦鴻.中醫在治療惡性腫瘤中的作用與地位[J].江蘇中醫,2001,22(11):1-3.

[2]劉英鋒,姚荷生.從寒溫理論溝通看厥陰主風病機與烏梅類方活用之理論探討[J].中華中醫藥雜志,2013,28(1):27-31.

[3]劉芳,謝鳴,朱麗瑤.烏梅丸現代主治病證的研究[J].北京中醫藥大學學報(中醫臨床版),2011,18(4):37-40.

[4]黃金昶,徐林.加味烏梅丸治療胰腺癌21例療效觀察[J].中國臨床醫生,2012,40(11):52-55.

[5]田衛中,胡旭隴.烏梅丸治療宮頸癌放療后引起的泄瀉[J].醫學理論與實踐,2004,17(1):63-64.

[6]孫麟,陳喬爾.Fas/FasL凋亡系統與腫瘤免疫逃逸研究進展[J].醫學綜述,2008,14(6):833-835.