鐵甲草水煎液對小鼠急性肝損傷的保護作用研究*

★ 林柳青 李翎* 王金鳳 符運舜

(1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院 廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學在讀研究生 廣東 廣州 510405)

鐵甲草(Cassia mimosoides Linn)為豆科(Leguminosae)決明屬植物，味甘、微苦，性涼，歸肝、腎和肺經，具有清肝明目、利水通淋和解毒消癰等功效，多用于濕熱黃疸、頭昏眼花、水腫和癰腫疔瘡等的治療[1]。鐵甲草在廣東梅州地區民間主要用于慢性乙型肝炎和肝纖維化的治療，而其對急性肝損傷的保護作用鮮有報道。我們以昆明(KM)小鼠為實驗對象，對酒精和四氯化碳(CCl4)引起的急性肝損傷模型進行了干預性治療，擬探討該藥物對急性肝損傷的保護作用。

1 材料

1.1 動物 SPF級KM小鼠，體重18g～22g，購自廣州中醫藥大學(大學城)實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2008-0020；動物飼料購自廣州中醫藥大學(大學城)實驗動物中心；動物實驗期間于廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心SPF動物實驗室(許可證號SYXK(粵)2008-0092)飼養和進行實驗。

1.2 藥物及試劑 鐵甲草水煎液：鐵甲草購自廣東梅州市蕉嶺縣，鐵甲草飲片加水煎煮，每次40分鐘，煎煮2次，合并煎液，過濾，濃縮至生藥濃度為2g/mL，冷藏保存，實驗前用蒸餾水稀釋成濃度為1.2g/mL(鐵甲草高劑量)和0.6g/mL(鐵甲草低劑量)的鐵甲草水溶液。

聯苯雙酯混合液：聯苯雙酯，由廣州市齊云生物技術有限公司生產，批號kbt201212。使用時，先加入2%吐溫-80充分混合后，再加入蒸餾水攪拌均勻，制得10mg/mL聯苯雙酯混合液。

50%乙醇溶液：無水乙醇(分析純)，由天津科密歐化學試劑有限公司生產，批號：20120206，使用時用蒸餾水配制成50%乙醇溶液。

2% CCl4：CCl4(分析純)，由江蘇強盛功能化學股份有限公司生產，批號：20121012，使用時用花生油稀釋成0.2%四氯化碳溶液。

氯化鈉(NaCl)注射液：由四川科倫藥業股份有限公司生產，批號：T100802。

測試試劑：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒，均來源于中生北控生物科技股份有限公司，ALT批號130401，AST批號130511。

1.3 儀器設備 離心機：上海安亭科學儀器廠，型號LDL-5-A；電子天平：上海越平科學儀器有限公司，型號YE20002；指標測試儀器：OLYMPUS AU5421全自動生化分析儀。

2 方法

2.1 酒精急性肝損傷動物模型實驗

2.1.1 動物與分組 KM小鼠50只，體重18～22g，隨機分成5組：正常對照組、模型組、聯苯雙酯組、鐵甲草高劑量組和鐵甲草低劑量組，每組10只，雌雄各半。

2.2.2 造模與給藥 各組先灌胃給藥，連續5天，每天1次。鐵甲草高、低劑量組分別按鐵甲草水煎液24g/kg、12g/kg給藥，聯苯雙酯組以聯苯雙酯混合液200mg/kg給藥，正常對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，給藥期間正常進食飲水。在給藥的第4天，除正常對照組外，其他各組動物制備急性酒精性肝損傷模型(50%乙醇灌胃1次，劑量為14mL/kg)，而正常對照組給予等體積生理鹽水，同時觀察小鼠的活動情況，第5天灌胃給藥后1h(造模后16h)摘眼球取血，離心，分離血清,測定血清轉氨酶ALT和AST。

2.2 四氯化碳急性肝損傷動物模型實驗

2.2.1 動物與分組 KM小鼠50只，體重18～22g，隨機分成5組：正常對照組、模型組、聯苯雙酯組、鐵甲草高劑量組和鐵甲草低劑量組，每組10只，雌雄各半。

2.2.2 造模及給藥 各組灌胃給藥，連續5天，每天1次。鐵甲草高、低劑量組分別按鐵甲草水煎液24g/kg、12g/kg給藥，聯苯雙酯組以聯苯雙酯混合液200mg/kg給藥，正常對照組和模型組等給予體積的生理鹽水，給藥期間正常進食飲水。在最后一次灌胃給藥后除正常對照組外，其余各組動物按20mL/kg腹腔內注射2% CCl4溶液，正常對照組則注射等體積的生理鹽水，觀察小鼠活動情況，在造模后16h摘眼球取血，離心，分離血清，測定血清轉氨酶ALT和AST。

3 結果

3.1 酒精急性肝損傷動物模型實驗 結果見表1。正常組與模型組比較，AST、ALT均有顯著性差異(P<0.01)，說明造模成功；聯苯雙酯組、鐵甲草低劑量組、鐵甲草高劑量組與模型組比較，ALT、AST均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；鐵甲草低劑量組、鐵甲草高劑量組與聯苯雙酯組比較，ALT、AST均無顯著性差異(P>0.05)；鐵甲草低、高劑量組間比較，ALT、AST均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 鐵甲草對酒精急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響±s，n=10)

3.2 四氯化碳急性肝損傷動物模型實驗 結果見表2。正常組與模型組比較，AST、ALT均有顯著性差異(P<0.01)，說明造模成功；聯苯雙酯組、鐵甲草高劑量組與模型組比較，ALT、AST均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；鐵甲草低劑量組、鐵甲草高劑量組與聯苯雙酯組比較，ALT、AST均有顯著性差(P<0.01)；鐵甲草低、高劑量組間比較，ALT有顯著性差異(P<0.01)，AST無顯著性差異(P>0.05)。

表2 鐵甲草對急性四氯化碳肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響±s，n=10)

4 討論

肝損傷是各種肝臟疾病的常見病變結果，急性肝損傷在臨床上很常見，包括病毒、酒精、藥物、免疫等原因引起的急性肝炎，有很多中草藥對急性肝損傷有很好的療效。鐵甲草在廣東梅州地區民間主要用于慢性乙型肝炎和肝纖維化的治療，本文通過觀察血清轉氨酶的變化，探討鐵甲草對急性肝損傷的保護作用。

從鐵甲草對酒精急性肝損傷動物模型的干預實驗可以看出，鐵甲草能有效的降低轉氨酶ALT和AST，其降酶的效果與聯苯雙酯相當，且高、低劑量的降酶效果相當，說明鐵甲草對于酒精造成的急性肝損傷有很好的保護作用。酒精對肝損害的機制尚未完全闡明，可能是炎癥和免疫肝損傷動物模型研究進展病理共同作用的結果，高濃度的酒精引起急性肝損傷產生大量毒性代謝產物和乙醛，并釋放腎上腺素引起肝臟血管收縮肝竇內壓升高和肝細胞缺氧，導致空泡變性肝細胞溶解壞死[2]。在肝細胞中ALT主要存在于胞漿，AST主要存在于線粒體，從本實驗看出，模型組ALT、AST顯著增高并且ALT增高的幅度比AST更大，表明酒精急性肝損傷動物模型所致的肝損傷以肝細胞膜的損傷為主。本實驗中，鐵甲草對酒精引起的急性肝損傷保護作用的機制可能與其有保護肝細胞膜的作用有關。

在鐵甲草對四氯化碳急性肝損傷動物模型的干預實驗中，筆者發現其降酶作用并不明顯，只有在高劑量時才有一定的療效，而且效果比聯苯雙酯差。CCl4導致肝損傷的主要機制目前認為與其自身和自由基代謝產物有關。CCl4代謝產生的自由基進入機體后，在肝臟經細胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由，攻擊肝臟細胞膜上的磷脂分子，使得細胞膜、內質網膜發生氯烷化和脂質過氧化，損傷細胞膜、細胞器；還能與膜脂質和蛋白質大分子進行共價結合，影響蛋白質代謝，并且破壞膜結構和功能的完整性，鈣離子內流增加，影響細胞正常生理功能，最終導致肝細胞胞質中的可溶性酶滲出，細胞死亡[3]。可見四氯化碳急性肝損傷動物模型對肝臟造成的損傷比較復雜，既有細胞膜的損傷，也有細胞器的損傷，從實驗結果也可看出，模型組ALT、AST均有明顯增高且增高幅度相當。在此實驗中，鐵甲草對急性肝損的保護作用在高劑量時有效。而在高劑量時，ALT比模型組約降低28%，而AST只降低約13%，這表明鐵甲草對于降低ALT的效果比AST好，從而提示其對肝細胞膜的保護作用效好，而對細胞器的保護作用較差。

在臨床中，急性肝炎所致的肝損傷一般以肝細胞膜的損傷為主，特別是損傷的早期，從而導致肝細胞壞死，轉氨酶升高。本研究發現鐵甲草對急性肝損傷有一定的保護作用，特別是對比較輕微的損傷的保護作用更明顯，有明顯的降酶效果，并且發現其機制為鐵甲草能夠有效地保護肝細胞膜，而對細胞器的保護作用較差。綜上所述，鐵甲草對急性肝炎，特別是急性肝炎的早期有一定的療效，有一定的應用前景，值得進一步研究其對肝細胞膜損傷保護作用的具體機制。

[1]宋立人,洪恂,丁緒亮,等.現代中藥大辭典[M].北京:人民衛生出版社,2001:184.

[2]周寧,厲有明.大鼠酒精性肝纖維化模型的構建[J].東南大學學報(醫學版),2003,22(2):93-97.

[3]Lesage G D, Benedetti A, Glaser S, et al. Acute carbon tetrachloride feeding selectively damages large, but not small, cholangiocytes from normal rat liver[J].Hepatology,1999,29(2):307-319.