HPLC法測定調血養發洗劑中歐前胡素的含量

★ 張岳 李養學 程青云 孫冬梅

(1.廣東省食品藥品職業技術學校 廣東 廣州 510663；2.廣東省中醫藥工程技術研究院 廣東 廣州 510095)

調血養發洗劑源于廣東省第二中醫院的臨床經驗方，由白芷、黃柏、干姜、側柏葉等中藥制備而成，具有清熱解毒、燥濕止癢、益發生發的功效。臨床主治脂溢性脫發，對頭皮發癢，頭屑多等有顯著療效。為了有效控制本產品的質量，保證用藥的安全和療效，本文采用HPLC法對君藥白芷中歐前胡素進行了含量測定，為補充和完善該制劑的質量標準及開發成臨床新藥奠定了良好的技術基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695-2498高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Mettler-Toledo XS205DU電子分析天平(瑞士)、MilliPore Advantage A10超純水機(美國)、HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海)、DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏設備有限公司)、KQ52300DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 歐前胡素對照品(110826-201013，含量以99.6%計算)、購于中國藥品生物制品檢定院；調血養發洗劑(批號：20120401、20120402、20120403)由廣東省第二中醫院制劑室提供；乙腈、甲醇為色譜純試劑(一級)；水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-水(48∶52)[1]；檢測波長為254nm；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃。在上述色譜條件下，歐前胡素與其他成分能較好分離，陰性對照溶液在歐前胡素對照品相同保留時間位置上未見色譜峰，說明陰性對照無干擾，見圖1～3。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對照品12.30mg，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取10mL，置于100mL量瓶中，加甲醇至刻度，即制得每1mL含歐前胡素24.5016μg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品約4mL，精密稱定，置蒸發皿中，加硅藻土適量吸附，蒸干，轉移至50mL量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理(功率300W，頻率50kHz)1小時，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，過0.45μm的微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

圖1 歐前胡素對照品HPLC圖譜

圖2 供試品HPLC圖譜

圖3 陰性對照HPLC圖譜

2.4 陰性對照溶液的制備 取按調血養發洗劑制備工藝制備的缺白芷的陰性樣品4mL，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制成白芷陰性對照溶液。

2.5 線性范圍的考察 精密量取“2.2”項下配制好的對照品溶液1,2,3,4,5mL，分別置5mL量瓶中，加入甲醇并稀釋至刻度，得歐前胡素的濃度分別為4.90032，9.80064，14.70096，19.60128，24.50160μg的對照品溶液。精密吸取上述溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，測定峰面積。以峰面積(Y)對歐前胡素含量(X)進行回歸，得標準曲線，Y=4239.8X-9114.5(r=0.9999)。歐前胡素在49.0032～245.0160 ng范圍內呈現良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液(10μg/mL)10μL連續重復進樣6次，測得峰面積積分值RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品(批號：20130401)溶液，分別于0，2，4，8，12 h進樣10μL，測得樣品中歐前胡素峰面積值的RSD<2%(n=5)，表明供試品溶液12小時內穩定性良好。

2.8 重現性試驗 取同一批樣品(批號：20130401)按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按擬定的含量測定方法，分別精密吸取10μL進樣，測得峰面積積分值并計算含量，得歐前胡素含量RSD<2%(n=6)，表明本方法重現性較好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品溶液(批號20130401)9份，每份精密量取2mL，分別精密加入“2.2”項下的歐前胡素對照品1，1.3，1.5mL(80%，100%，120%)三種不同濃度的母液，按“2.3”項下方法處理，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算平均回收率為99.30%，RSD為1.42%(n=9)，表明本含量測定方法準確度高，方法可靠，結果見表1。

表1 歐前胡素加樣回收率測定結果(n=9)

2.10 樣品測定 取不同批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行含量測定，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=2，mg·mL-1)

3 討論

白芷為本制劑的君藥，歐前胡素為白芷的主要有效成分，故選擇歐前胡素作為控制本品質量的指標成分。含白芷的中藥復方制劑中歐前胡素的含量測定方法，文獻報道有薄層色譜法和高效液相色譜法等[2,3]。試驗中曾參照《中國藥典》2010年版一部白芷的含量測定方法，結果歐前胡素色譜峰分離度較差，有包峰出現，嘗試改變流動相的比例，但出峰太慢，分析時間較長，且分離度改善不大。通過查閱文獻，改變流動相，實現了歐前胡素色譜峰與其它成分色譜峰的良好分離，且保留時間適中，出峰時間較早，峰形對稱。另外，試驗中對不同色譜柱，流速以及柱溫等因素進行了考察，最終確定以本文所述方法測定調血養發洗劑中歐前胡素的含量。方法學考察結果表明，該方法簡便、靈敏度高、重現性好、結果準確，可用于本品的質量控制，為今后開發成臨床新藥奠定了良好的技術基礎。

[1]鄭立紅,李衛敏,陳志峰.不同產地白芷中歐前胡素的含量測定[J].世界中醫藥,2012,7(1):79-80.

[2]李海燕,岑志芳,林玉明.中藥新藥復方天麻頭風膠囊中白芷的含量測定研究[J].時珍國醫國藥,2006,17(6):965-966.

[3]姜雪,王萍,王洋,等.興安白芷種子歐前胡素含量的HPLC分析及不同產地的含量測定[J].林產化學與工業,2008,28(3):101-103.