星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化菊花提取工藝

★ 邵考珍 譚梅英 詹利之

(1.廣東省佛山市南海區(qū)第七人民醫(yī)院 佛山 528248；2.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心 廣州 510405)

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序。9-11月花盛開時(shí)分批采收，陰干或焙干，或熏、蒸后曬干。藥材按產(chǎn)地和加工方法不同，分為“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”。菊花作為藥食兩用植物，具有散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒的功效；用于風(fēng)熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花，瘡癰腫毒等癥[1]。現(xiàn)代藥理表明，菊花總黃酮具有降血壓，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，防止冠脈粥樣硬化等作用，臨床上用于治療高血壓和冠心病[2]。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化菊花提取工藝，研究各因素與菊花總黃酮之間的交互關(guān)系，得到擬合度優(yōu)良的回歸方程，實(shí)現(xiàn)對(duì)菊花提取工藝的優(yōu)化。

1 儀器與試藥

UV-9100紫外-可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)；AE-240電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

菊花(購于廣州致信藥業(yè)有限公司，批號(hào)121107)，經(jīng)鑒定為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，為正品；蘆丁對(duì)照品(購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100080-200306)；95%乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定[3-5]

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25.21mg，置50mL量瓶中，加乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取25mL，置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1mL含蘆丁對(duì)照品0.2521mg)。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6mL，分別置25mL量瓶中，各加50%乙醇至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外-可見分光光度法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅤA)，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.01156C+0.0048(r=0.9993)。結(jié)果表明蘆丁在10.084-60.504μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 測(cè)定法 精密量取提取液(表2試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得)1.0mL，置10mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1mL，置25mL量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加50%乙醇至6mL”起依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計(jì)算總黃酮的收率，即得。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化菊花提取工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用回流提取法，固定提取溫度為80℃，提取次數(shù)為2次，考察乙醇濃度、溶劑體積與提取時(shí)間3個(gè)因素。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每因素設(shè)5個(gè)水平，用代碼值-α、-1、0、1、α來表示(3個(gè)因素星點(diǎn)設(shè)計(jì)的α=1.682)。因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表1 菊花總黃酮提取工藝因素水平

表2 菊花總黃酮提取工藝設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert，對(duì)各因素進(jìn)行多元回歸擬合，并以ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。由表3可知，各因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)都達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。菊花總黃酮提取率對(duì)乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)和提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=-3.71102+0.092298A+0.56765B+0.058736C+3.12500×10-4AB-6.25000×10-5AC+1.45833×10-4BC-6.63886×10-4A2-0.022784B2-3.50058×10-4C2

式中，Y-總黃酮提取率(%)；A、B、C-分別代表乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間。該方程的相關(guān)系數(shù)r=0.9871，模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)不同條件下菊花總黃酮提取率的進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 二次回歸方程方差分析

2.2.3 提取工藝優(yōu)化與驗(yàn)證 采用Design-Expert軟件，作出相應(yīng)的曲面圖和等高線圖，如圖1～6所示。結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，菊花總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇濃度為68.83%，乙醇用量為13.19倍，提取時(shí)間為80.46min。總黃酮理論提取率為5.5721%。對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，菊花總黃酮平均提取率為5.4935%，RSD為1.83%(n=5)，表明所建立的回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選的工藝條件重現(xiàn)性好。

圖1 乙醇濃度與乙醇用量對(duì)總黃酮提取率影響等高線圖

圖2 乙醇濃度與乙醇用量對(duì)總黃酮提取率影響3D響應(yīng)面圖

圖3 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響等高線圖

圖4 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響3D響應(yīng)面圖

圖6 提取時(shí)間與乙醇用量對(duì)總黃酮提取率影響3D響應(yīng)面圖

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化菊花的提取工藝[3-7]，即用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，試驗(yàn)次數(shù)雖少，但精度不夠，預(yù)測(cè)性較差。星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國(guó)外常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。該法采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以提高實(shí)驗(yàn)精度，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值。

本文采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選菊花的提取工藝，最終確定其最佳提取條件。在最佳條件下，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較吻合，相對(duì)偏差較小。本研究為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法應(yīng)用于中藥提取工藝的優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：292.

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[4]王加文，洪建華，雷志強(qiáng).菊花總黃酮提取工藝研究[J].河北化工，2010，33(12)：19-25.

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