化合物T44的抗腫瘤活性研究

張 晶，張智慧，劉 偉，陳云雨，王艷宏，司書毅*（.中國醫學科學院醫藥生物技術研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室，北京 00050；.黑龍江中醫藥大學藥學院藥劑教研室，黑龍江 哈爾濱 50040）

·論著·

化合物T44的抗腫瘤活性研究

張 晶1，張智慧2，劉 偉1，陳云雨1，王艷宏2，司書毅1*
（1.中國醫學科學院醫藥生物技術研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室，北京 100050；2.黑龍江中醫藥大學藥學院藥劑教研室，黑龍江 哈爾濱 150040）

目的評估化合物1-[4′-（（3R,5R）-金剛烷基）苯基）]正丁胺鹽酸鹽（T44）的體外抗腫瘤活性，并初步探索可能的分子機制，為這種化合物的綜合應用提供實驗依據。方法四甲基偶氮唑藍比色法檢測T44對細胞的體外生長抑制作用；細胞形態觀察法研究T44對細胞形態的影響；流式細胞儀法檢測T44作用下腫瘤細胞周期和凋亡率的變化；蛋白印跡法檢測T44對不同周期蛋白表達的影響；細胞劃痕實驗檢測T44對腫瘤細胞遷移能力的影響。結果T44對檢測的11株腫瘤細胞的增殖均有抑制效果，對正常細胞人胚肺成纖維細胞也具有一定的增殖抑制作用，半數抑制濃度值為（16.58±3.49）μmol/L，高于受測的大部分腫瘤細胞；T44能導致腫瘤細胞凋亡和周期阻滯；T44能影響周期蛋白的表達并能降低HCT116細胞的遷移能力。結論T44主要通過促進細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用。

抗腫瘤藥；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

癌癥的主要特征為細胞無限增殖[1]，這主要是由細胞周期、代謝紊亂等一系列病理變化致使細胞增殖失控、凋亡障礙所導致，已成為影響人類健康的一大主要難題。據美國癌癥協會（AmericanCancerSociety，ACS）最新公布的一份統計報告稱，在2012年有約1 640 000例新發癌癥病例被確診，因癌癥而離世的美國人達到577 000例，約1 500例/d[2]。我國腫瘤登記中心發布的《2012中國腫瘤登記年報》統計，我國每年新發腫瘤病例約為3 120 000例，每分鐘有6例被診斷為癌癥[3]。抗腫瘤藥物作為腫瘤治療的重要形式在腫瘤的臨床治療中發揮著關鍵性作用，需求越來越大。目前在抗腫瘤藥領域中生物藥物、小分子藥物、激素及相關藥物發展勢頭迅猛，占有較大的市場份額[4]。因此，尋找高效、低毒的抗腫瘤小分子化合物新藥仍是我國乃至世界藥物學家研究的一個迫切課題。本研究利用一系列的細胞生物學和分子生物學等技術手段檢測了新型小分子化合物T44的抗腫瘤活性，并對其作用效果作初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物和細胞株：1-[4′-（（3R,5R）-金剛烷基）苯基）]正丁胺鹽酸鹽（T44），北京百靈威科技有限公司提供。人肺癌細胞（A549），人宮頸癌細胞（Hela），人乳腺癌細胞（MCF-7），人骨肉瘤細胞（U2OS），人肝癌細胞（HepG2），人成骨肉瘤細胞（MG63），人結直腸腺癌細胞（HT-29），人前列腺癌細胞（PC3），人結直腸腺癌細胞（HCT116），人肝癌細胞（Bel-7402），中國倉鼠卵巢癌細胞（CHO），均由本實驗室保存。人胚肺成纖維細胞（MRC-5）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。

1.2 主要試劑和儀器：周期蛋白D1、A、B1一抗（南京生物世界科技有限公司），四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyltetrazolium,MTT，Sigma公司），RNA酶A（RNaseA，Sigma公司），碘化丙啶（propidiumiodide,PI，Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。流式細胞儀（BeckmanCoulter），EnVision全自動酶標儀（PerkinElmer），凝膠成像儀（Bio-Rad），倒置顯微鏡（Nikon）。

1.3MTT法檢測細胞生長抑制率：取對數生長期細胞，調整細胞密度為2×104～5×104個/mL，接種于96孔培養板中。貼壁后加樣，同一濃度設雙復孔。培養48h，加入MTT孵育4h，再加入DMSO振蕩15min使生成的甲簪晶體充分溶解。酶聯免疫檢測儀測定570nm波長處吸收值。計算公式，細胞抑制率（%）=1-[（OD受試藥組-OD空白組）/（OD正常組-OD空白組）]×100%應用GraphPadPrism5計算T44對細胞生長的半數抑制濃度（halfmaximal（50%）inhibitoryconcemtration，IC50）。

1.4 顯微鏡觀察細胞形態：以1×106細胞數/孔接種HCT116于6孔培養板，待細胞貼壁后，加入T44（6.24μmol/L），繼續培養48h，100×倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.5Westernblotting檢測周期蛋白的表達：收集T44孵育后的細胞，BCA法檢測蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelpolyacrylamidegel，SDS-PAGE）電泳，并轉至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加入一抗（稀釋比1∶1 000）4℃過夜，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液（trisbufferedsalinetween,TBST）洗膜，加入二抗（稀釋比1∶5 000），室溫孵育1h，洗膜，加入化學發光液后曝光，觀察結果。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡：收集T44孵育后的細胞，以70%冰冷乙醇固定，4℃儲存過夜。PBS洗滌、重懸細胞，加入RNaseA37℃恒溫孵育30min后，室溫下加入PI孵育30min，PBS洗滌，于1h內上流式細胞儀檢測，以ModFitLT軟件分析結果。收集T44孵育后的細胞，用4℃預冷的PBS洗2次，結合緩沖液懸浮細胞，調節其濃度為1×106個/mL，加入AnnexinV/FITC孵育30min，上機前5min再加入PI，流式細胞儀檢測，以ModFitLT軟件分析結果。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力：6孔培養板接種HCT116細胞，待細胞貼壁后，用滅過菌的牙簽在平板底部垂直劃水平細痕，PBS洗去劃落的細胞，T44組濃度為6.24μmol/L，對照組含有相應DMSO的培養基，0、6、24、48h后鏡下拍照，計算相對遷移率。

2 結 果

2.1T44抑制腫瘤細胞增殖：T44可抑制多種腫瘤細胞系的增殖，隨著劑量的增加，細胞抑制率逐漸增加，呈劑量依賴效應，IC50值均在μmol/L水平，且隨細胞系不同抑制作用也呈現差異，其中對HCT116和Bel-7402的抑制效果最明顯，IC50值相當，分別為（1.19±0.06）μmol/L和（1.20±0.04）μmol/L，后續的實驗選取HCT116細胞系進行。同時又檢測了化合物對正常細胞MRC5的毒性，其IC50值為（16.58±3.49）μmol/L，高于大部分受檢的腫瘤細胞。見表1。

CelllinesIC50CelllinesIC50HCT1161．19±0．06MCF?710．05±0．58MG636．76±0．04PC33．08±0．05HT?2921．58±3．00Bel?74021．20±0．04HepG235．35±1．40U2OS5．91±0．12Hela27．17±1．10CHO6．69±1．88A54919．50±3．47MRC516．58±3．49

2.2 T44影響細胞形態：顯微鏡下觀察，對照組細胞貼壁生長大小均勻，胞體圓整，胞質透亮，折光性好，增殖旺盛，形態規則，輪廓清晰（圖1A）。T44（6.24μmol/L）處理后大部分細胞形態發生變化，呈圓形皺縮，單個散在細胞間距明顯變大，胞體縮小，并從培養皿壁上脫落，細胞間連接消失，數量較對照組細胞數明顯減少（圖1B）。

圖1 T44對HCT116細胞形態的影響（ ×100）

A.對照細胞；B.T44作用下的HCT116細胞

Figure 1 The influence of T44 on HCT116 cellular morphology（ ×100）

A.Control;B.HCT116 cells after treatment with T44

2.3 T44促進腫瘤細胞凋亡：Annexin V/FITC-PI雙染法結果顯示，T44能促進HCT116細胞的凋亡。在12h和24h，隨著T44劑量增大，細胞凋亡（包括早期凋亡和晚期凋亡）均呈現顯著的增長趨勢，最高濃度24.96μmol/L作用下，顯示出明顯的促凋亡作用；24h死亡細胞的比例明顯增長，24.96μmol/L作用下促凋亡作用轉向殺傷作用。見表2。

GroupsApoptosis12h24hControl11．93±1．5012．41±2．616．24μmol/L34．77±2．88?29．15±3．33?12．48μmol/L39．55±2．58?31．43±2．50?24．96μmol/L85．28±3．35?#△45．47±3．25?#△ F28．20963．370 P<0．01<0．01

*P<0.01vscontrol #P<0.01vs6.24μmol/L △P<0.01vs12.48μmol/L byqtest

2.4 不同濃度T44對腫瘤細胞周期的影響：流式檢測結果顯示，作用48h隨著T44劑量增加，G0/G1期細胞比例逐漸降低，6.24μmol/L濃度組較對照組明顯降低（P<0.05），12.48μmol/L濃度組則較其他各組均降低（P<0.05）；S期細胞變化均不太明顯，各濃度組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；G2/M期呈逐漸增高趨勢，1.56μmol/L組低于對照組，3.12μmol/L組和6.24μmol/L組高于1.56μmol/L組，12.48μmol/L高于對照組和1.56μmol/L組（P<0.05）。見表3。

GroupsG0/G1SG2/MControl82．43±1．826．32±2．7511．25±2．031．56μmol/L84．59±1．779．39±0．646．02±1．93?3．12μmol/L79．43±2．126．03±1．8614．54±2．82#6．24μmol/L76．88±3．83?7．06±2．7416．07±2．95#12．48μmol/L69．64±3．00?#△☆10．89±2．6719．47±3．54?# F14．5712．56810．565 P0．0000．1030．001

*P<0.05vscontrol #P<0.05vs1.56μmol/L △P<0.05vs3.12μmol/L ☆P<0.05vs6.24μmol/L byqtest

2.5 T44作用不同時間對腫瘤細胞周期的影響：流式檢測結果顯示，對照組和6.24μmol/L濃度組細胞比例隨著T44作用時間的增加均逐漸增加，特別是6.24μmol/L組在72h G0/G1期的細胞比例高于24、36、48和60h（P<0.05）；對照組和6.24μmol/L濃度組S期細胞比例隨著T44作用時間的增加逐漸減少，對照組培養36、48、60和72h S期細胞的比例明顯低于24h，6.24μmol/L濃度組則48、60和72h明顯低于24h和36h（P<0.05）；對照組不同培養時間G2/M期細胞比例差異無統計學意義（P>0.05），6.24μmol/L濃度組36h和48h G2/M期細胞的比例高于24h（P<0.05），60h G2/M期細胞的比例低于36h（P<0.05），72h G2/M期細胞的比例低于24、36、48和60h（P<0.05）。見表4。

TimeG0/G1Control6．24μmol/LSControl6．24μmol/LG2/MControl6．24μmol/L24h49．90±3．1149．83±5．2540．13±4．7443．72±7．759．97±1．766．44±2．06 36h71．25±3．36?66．64±5．1810．38±3．76?19．29±3．69?18．37±0．5614．07±2．63?48h80．29±6．68?#76．66±3．30?#6．09±2．27?9．04±0．99?#13．62±1．7814．31±0．68?60h85．20±7．39?#84．13±2．39?#5．38±3．55?5．75±0．41?#9．42±1．6710．11±2．94#72h86．66±1．64?#92．08±3．68?#△☆5．68±1．79?5．28±1．75?#7．66±0．562．64±0．91?#△☆F27．81547．67867．41150．3481．60817．922P0．0000．0000．0000．0000．2470．000

*P<0.05vs24h #P<0.05vs36h △P<0.05vs48h ☆P<0.05vs60h byqtest

2.6 T44影響周期蛋白的表達量：與對照組比較，T44作用24h后3種周期蛋白的表達無差異；48h時Cyclin D1表達量降低，Cyclin A和Cyclin B1表達量升高，隨著作用濃度的升高，Cyclin D1表達量降低，Cyclin A和Cyclin B1表達量升高。見圖2。

圖2 T44對不同周期蛋白表達的影響

1.48h,對照；2.48h,3.12μmol/L;3.48h,6.24μmol/L;4.24h,對照;5.24h,3.12μmol/L

Figure 2 The influence of T44 on different cyclins

1.48h,control；2.48h,3.12μmol/L; 3.48h,6.24μmol/L;4.24h,control; 5.24h,3.12μmol/L

2.7 T44降低腫瘤細胞的遷移率：100×顯微鏡下的細胞遷移實驗結果顯示，與對照組相比，加藥組（6.24μmol/L）細胞的遷移能力顯著減弱。6h 2組相對遷移率接近，隨著時間延長，加藥組的遷移抑制作用愈加明顯，48h 2組細胞的相對遷移率相差了一倍以上。見圖3。

圖3 T44對HCT116細胞相對遷移率的影響
Figure 3 The influence of T44 on migration ability of HCT116 cells

3 討 論

在我國，惡性腫瘤已成為影響人民健康的最大危險因素之一，對腫瘤防治機制的研究，是現代醫學特別是臨床非常重要的課題[5]。在過去的5～10年時間里，抗腫瘤藥物的研發始終是創新藥物研發最為活躍的領域，大約占所有國家食品藥品監督管理局受理申報的創新藥1/3左右。

本實驗室致力于尋找新型的具有抗腫瘤活性的先導小分子化合物，得到了化合物T44。從本研究結果分析，T44能抑制腫瘤細胞的增殖，且對不同細胞系的抑制活性不同，其中對HCT116和Bel-7402的抑制作用最為明顯，MG63、PC3、U2OS和CHO的作用稍次，而對HT-29、HepG2、Hela、A549、MCF-7和正常細胞MRC-5的抑制作用相當，有可能與此化合物作用的靶點蛋白在這幾種細胞系中的表達量不同有關，這也就決定了對細胞系的敏感性不同。本研究結果還表明T44對腫瘤細胞系的增殖抑制作用有可能是通過促進周期阻滯和凋亡來完成的，其中促凋亡作用更加顯著。本研究中值得一提的是，T44在導致HCT116細胞的周期阻滯時在量效和時效上出現了不同的效應，隨著作用時間的延長，與自身相比，HCT116細胞的G0/G1期比例增加；而隨著化合物作用濃度的增大，與自身相比，HCT116細胞呈現出不同的周期阻滯，即G0/G1期比例減少，這其中可能的原因在于化合物T44的是多靶點抑制劑，在延長時間和增加給藥量的情況下，不同的靶點蛋白活性受到了抑制，因此導致出現不同的周期阻滯，也可能正是由于多靶點的作用，使得T44的促凋亡作用非常明顯。腫瘤的發生發展是多步驟的過程，惡性腫瘤形成以后細胞經過不斷的突變和選擇，其惡性行為逐步升級，涉及許多基因的激活并參與作用，因此腫瘤的治療也需要多角度進行[6]。目前單一靶點的小分子化合物類藥物的抗腫瘤治療范圍窄，難以達到理想的阻斷惡性腫瘤細胞賴以發生、發展的相關信號通路網絡，多靶點藥物簡化了治療程序，成為一個新的研究趨勢[7]。接下來我們又檢測了3種與細胞周期密切相關的周期蛋白在T44作用下的蛋白表達情況。Cyclin A是細胞周期進入S期所必須的調節蛋白[8]，它的過表達將導致處于S期的細胞明顯增多，促進細胞增殖。Cyclin B1活性的發揮對細胞能否通過G2/M檢驗點進入M期起決定性作用[8]。G1期的啟動是細胞周期的關鍵，Cyclin D1是G1/S期調控點重要的正向調控因子[9]。Western blotting結果與此相符。轉移是惡性腫瘤細胞的重要特征之一。細胞遷移是惡性腫瘤侵襲和轉移中的關鍵步驟之一，具有侵襲性的腫瘤細胞有較強的運動性，腫瘤細胞的無限增殖是腫瘤生長和遷移侵襲的前提條件，腫瘤轉移至遠處器官后，最終發生多器官受累加速患者死亡[10]。接下來我們檢測了T44對HCT116細胞增殖和遷移能力的影響。結果顯示T44作用后HCT116細胞的增殖和遷移活性顯著降低，加藥組的細胞劃痕面積較對照組顯著減少，證實T44具有降低腫瘤遷移能力的作用，能抑制體外培養的人結直腸腺癌的轉移。

總之，本研究首次驗證了T44的體外抗腫瘤活性，結合前期研究工作，提示具有較好的抗腫瘤研究和開發前景，表明該化合物具有進一步研究的價值。下面的工作主要考慮從兩個方面進行：一是對化合物進行結構改造來進一步提高其抗腫瘤指標；另一方面是從與周期、凋亡和遷移有關的蛋白入手來確定T44的作用靶點。由于其促凋亡作用非常顯著，考慮先從與凋亡相關的靶點蛋白入手，目前發現的凋亡相關蛋白主要包括凋亡促進因子如Bax、Bak等及凋亡抑制因子如Bcl-2等[11]，其確切機制尚需進一步研究。本研究為新的抗腫瘤藥物的發現和改造奠定了基礎。

[1] TEICHER BA,LINEHAN WM,HELMAN LJ.Targeting cancer metabolism[J].Clin Cancer Res,2012,18（20）:5537-5545.

[2] SIEGEL R,NAISHADHAM D,JEMAL A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,63（1）:11-30.

[3] 李秋萌.全國每分鐘有6人被確診為癌癥[N].京華時報，2013-01-10（A05）.

[4] 田紅,肖桂芝,劉永貴.抗腫瘤藥物市場分析[J].現代藥物與臨床,2013,28（3）:424-427.

[5] 李國慧,頡玉欣,郭曉華.苦參堿抑制人卵巢癌細胞株A2122 增殖與誘導凋亡的實驗研究[J].河北醫科大學學報,2008,29（3）:367-369.

[6] 李海峰,劉鐵軍,劉海波,等.COX-2及Survivin在涎腺腺樣囊性癌中的表達[J].河北醫科大學學報,2008,29（5）:694-696.

[7] 鄭軍,范松青.靶向抗腫瘤小分子化合物類藥物的研究[J].國際腫瘤學雜志,2012,39（3）:172-175.

[8] 魏秀梅,白楊,葉龍,等.細胞周期調控與卵巢癌[J].吉林醫藥學院學報,2013,34（3）:205-207.

[9] 陳艷昕,劉慶濱,顧濤.細胞周期素D1、S期激酶相關蛋白2與p27kip1在結直腸癌中的表達及相關性研究[J].臨床薈萃,2012,27（15）:1335-1337.

[10] 陳科全,陳學清,翟國棟,等.Syndecan-1對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響[J].胃腸病學,2013,18（7）:406-410.

[11] 冉廣宇,楊彥彪.鹽酸小檗堿對人乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡的影響[J].臨床薈萃,2013,28（6）:683-685.

（本文編輯：許卓文）

RESEARCHONANTI-TUMOREFFECTSOFCOMPOUNDT44

ZHANGJing1，ZHANGZhihui2，LIUWei1，CHENYunyu1，WANGYanhong2，SIShuyi1*
（1:InstituteofMedicinalBiotechnologyAcademy,MedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,theNational
LaboratoryforScreeningNew（Microbial）Drugs（LSMD），Beijing100050,China;2.DepartmentofPharmaceutics,
CollegeofPharmacy,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,HeilongjiangProvince,Haerbin150040,China）

ObjectiveInordertoprovideexperimentalevidenceforthecomprehensiveapplicationofcompoundT44,weexploredthepossiblemechanismsofitsanti-tumoreffects.MethodsMTTassaywasusedtomeasurecellproliferation.Transitionofcellcycleandapoptosisweretestedbyflowcytometer,respectively.Capacityofcellmigrationwasdetectedbyscratchassay.Westernblottingwasappliedfordeterminingtheexpressionofdifferentcyclins.DetectionofcellmorphologychangewasutilizedtoobservetheinfluenceonHCT116cells.ResultsTheproliferationof11kindsoftumorcelllinesweredecreasedmarkedlyascomparedwiththoseofcontrolcells,andtheyshoweddistinctsensibilitywithoneanother.Halfmaximal（50%）inhibitoryconcemtrationofhumanlungfibroblastswas（16.58±3.49）μmol/L,higherthanmostofthetumorcelllines.T44treatedHCT116cellsdecreasedcellmigrationandalteredcyclinsexpression,aswell.T44couldalsoleadtocellcycleblockandapoptosis.ConclusionT44participatedintothecontroloftumorproliferationprobablybymodulationofcellcycleandinductionofapoptosis.

antineoplasticagents；cellproliferation；cellcycle;cellproliferation

2014-02-22；

2014-04-20

國家自然科學基金青年科學基金（81001387）

張晶（1981-），女，河北石家莊人，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所助理研究員，醫學博士，從事抗腫瘤藥物篩選及活性評價研究。

*通訊作者。E-mail:sisyimb@hotmail.com

R979.1

A

1007-3205（2014）05-0517-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.009