半翼基因蛋白在實驗鼠卵細胞聯會復合體中的表達位置

張金文，杜春海，汪 冉（.河北醫科大學第二醫院血管外科，河北 石家莊 050000;.河北省景縣人民醫院外科,河北 景縣 05500;.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000）

·論著·

半翼基因蛋白在實驗鼠卵細胞聯會復合體中的表達位置

張金文1，杜春海2，汪 冉3
（1.河北醫科大學第二醫院血管外科，河北 石家莊 050000;2.河北省景縣人民醫院外科,河北 景縣 053500;3.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000）

目的探討半翼基因（wings apart-like,Wapl）蛋白在實驗鼠粗線期的卵細胞中聯會復合體（synaptonemal complex，SC）的表達位置。方法從受孕18.5d胎鼠的卵巢中分離出處于粗線期的卵細胞，然后用抗-聯合復合體蛋白2（anti-synaptonemal complex protein 2,SYCP2）和 抗-Wapl蛋白進行雙免疫染色。結果SYCP2和Wapl在所檢查粗線期的卵細胞位置重疊。結論Wapl可能是粗線期卵細胞SC的一部分。

合子；聯會復合體；蛋白質類；大鼠

果蠅半翼基因（wingsapart-like,Wapl）蛋白在調解異染色質形成和染色體分離中起重要的作用[1-2]。在人和實驗鼠體內，Wapl主要在睪丸內表達[3]。免疫細胞染色發現實驗鼠Wapl位于粗線期的精母細胞聯會復合體（synaptonemalcomplex，SC）中[3]。SC是一個減數分裂的特異結構，它由橫絲（transversefilaments，TFs）相連的一對側板（lateralelements，LEs）組成，它在第1次減數分裂的粗線期成熟。在第1次減數分裂的前期，SC精密的調整著一系列的反應，包括染色體配對、SC裝配、同源染色體之間遺傳物質互相交換（交叉重組）。這些事件確保了在第1次減數分裂同源染色體保持聯接在一起并在保證它們準確地排列在赤道板上，以及隨后向著相反的紡垂體移動。同源染色體識別錯誤或同源染色體遺傳物質交換障礙必定會破壞同源染色體的分離和移動，導致產生非整倍體配子[4]。在許多減數分裂的基因突變的研究中，已證實SC的形成或解體與同源染色體正常分離有密切相關性[1，5-6]。已證實在缺乏聯合復合體蛋白3（synaptonemalcomplexprotein3，SYCP3）實驗鼠的卵細胞中，由于SYCP3缺陷的誘導致使減數分裂染色體錯誤隔離而產生非整倍體配子[7]。由于SC功能上的重要性，我們研究了雌性實驗鼠生殖細胞中Wapl可能存在的位置，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗鼠：C57BL/6N實驗鼠（BarHarbor,ME，證號129P2/01aHsd）喂養在標準的設施內，室溫控制在22℃，12h光照，12h黑暗，水和食物擺放在實驗鼠能自由接觸的位置。2只成年雌鼠和1只雄鼠放入一個籠子內，標記有陰道精斑雌鼠，于18.5d從胎鼠中采集處于粗線期的卵細胞。

1.2 胎鼠卵巢粗線期卵細胞的采集：采用“dry-down”技術，在受孕后18.5d，從雌性胚胎收集卵巢[8]。解剖出胚胎的卵巢放入PBS液體中，轉移到hypo-extractionbuffer液體25～30min。每對卵巢放入25μL100mmolSucrose器皿中,用注射器針頭搗碎，10μL懸浮液滴到玻璃載物片，該玻璃載物片事先用新鮮配制的1%PFA液體浸泡。玻璃載物片立即放入濕熱箱讓其慢慢晾干2～6h，然后洗滌玻璃載物片用0.04%KodakPhotoFlo液體，空氣晾干玻璃載物片，在相差顯微鏡下，粗線期的生殖細胞呈現為體積大而蓬松的形狀。晾干的玻璃載物片-20℃或-80℃儲存直到下一次應用。

1.3 免疫熒光染色：粗線期的卵細胞，在37℃的條件下分別與第一抗體及第二抗體孵化1h，隨后，在37℃的條件下用PBS洗刷。這些卵細胞與2種第一抗體多克隆荷蘭豬抗-SYCP2（1∶500稀釋）[9]和多克隆荷兔抗-Wapl（1∶400稀釋）[3]共同孵育，然后，按1∶1 200稀釋affinity-purifiedCy3-conjugated兔抗鼠IgG（JacksonImmuno-ResearchLaboratories,Suffolk,UK）和1∶100稀釋豬抗兔異硫氰酸熒光素（DakoCytomation,Glostrup,Denmark）。核染色質用DAPI（400μg/L;SigmaD-9542,Sigma-AldrichInc;St.Louis,MO,USA）進行染色2min，用PBS迅速洗滌卵細胞，以抗褪色劑（MolecularProbes;Eugene,OR,USA）封閉玻璃載物片。利用顯微鏡（LeicaDMRA2andDMRXA：LeicaMikroskopieunderSystemGmbH;Wetzlar,Germany）和螢光顯微鏡（×1 000）以及照相機（C4742-95（HamamatsuPhotonicSystems;Hamamatsucity,Japan）記記下卵細胞的形態變化并用OpenlabTMsoftwareversion3.1.4（ImageProcessing&VisionCompanyLimited;Coventry,UK）進行分析。

2 結 果

Wapl和SYCP2（哺乳類動物卵細胞中SC的一個標志蛋白）在粗線期的卵細胞中處于重疊位置（圖1）。

圖1Wapl與SYCP2在實驗鼠粗線期的卵細胞SC上呈重疊分布（免疫組織化學 ×1 000）
Figure1ColocalizationofWaplwithSYCP2ontheSCinthemousepachyteneoocytes（immunohistochemistry×1 000）

A.伸展和固定的卵細胞染色體被抗-SYCP2染成紅色；B.抗-Wapl呈綠色;C.A+B合并
A.Chromosomalspreadofoocytesatpachynemafixedandstainedwithanti-SYCP2 （red）;B.anti-Wapl（green）;C.mergedimage

3 討 論

Wapl最早是在果蠅體內發現的，其所編碼的蛋白可調節異染色質的結構，突變的Wapl基因在異染色質區域阻止了姐妹染色單體的正常靠近和并列，但不影響染色體的凝集和分離。Wapl基因在有絲分裂的異染色質區域對于維持姐妹染色單體的粘連起著非常重要的作用，同時也調節染色體的功能[1-2]。目前，在人類約有20%不孕癥及胚胎死亡是由卵細胞染色體非整倍體引起。0.3%新生兒患有智能障礙，如先天愚型兒，也是由卵細胞染色體異常所引起，但其發病機制還不十分清楚。已證實實驗用鼠的Wapl位于粗線期的精母細胞聯會復合體。且已證實實驗用鼠的Wapl位于粗線期的精母細胞SC[3]。目前已證實SC的形成或解體與同源染色體正常分離有密切相關性[1，5-6]。在缺乏SYCP3的條件下，實驗鼠的卵細胞由于SYCP3缺陷的誘導致使減數分裂染色體錯誤隔離而產生非整倍體配子[7]。有研究[10-11]證實人類Wapl是一種黏性結合蛋白質，它能促進姊妹染色單體在有絲分裂前期分離。Wapl在Hela細胞的消耗能導致早中期類的細胞堆積，這些細胞染色體的姊妹染色單體極少分離，相反，Wapl的過度表達能引起姊妹染色單體在成熟前期分離，它提示Wapl在減數分裂中同黏性結合蛋白質（染色體精確分離所必須的蛋白質）一樣起著調解染色體分離的作用。在本研究中我們首次證實在實驗鼠卵細胞中Wapl與SC重疊分布，與在粗線期的精母細胞的Wapl與SC重疊分布相一致[3]。這些結果預示Wapl參與減數分裂中染色體的組裝過程。

Wapl表達異常可能干擾實驗鼠生殖細胞正常分裂與成熟，Wapl與SC的確切的分子結構關系以及Wapl在人類不孕不育疾病中發病機制有待以后進一步研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSIONOFWINGSAPART-LIKEPROTEINLOCALIZATIONONSYNAPTONEMALCOMPLEXINMOUSEOOCYTES

ZHANGJinwen1,DUChunhai2,WANGRan3
（1.DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofSurgery,theJingxianRenminHospital,HebeiProvince,Jingxian053500,China;3.Departmentof
ClinicalLaboratory,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China）

ObjectiveInordertoanalyzethecorrelationofthewingsapart-like（Wapl）proteinandthesynaptonemalcomplex（SC）ofpachyteneoocytes.MethodsThepachyteneoocyteswereisolatedfromfoetalmiceovariesat18.5danddoubleimmunostainedwithanti-synaptonemalcomplexprotein2 （SYCP2）andanti-Wapl.ResultsInthepachyteneoocytesexamined,mouseWaplwascolocalizedwithSYCP2ontheSC.ConclusionWaplmaybeapartofpachyteneoocyteSC.

zygote；synaptonemalcomplex；proteins；rats

2014-01-08；

2014-04-02

張金文（1960-），男，河北景縣人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，醫學博士，從事血管外科疾病診治研究。

R349.64

A

1007-3205（2014）05-0527-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.011