快速高效從石蠟包埋腫瘤組織中提取micro-RNA方法的研究

李江超，楊 揚，郝卓芳，周曉明，章倩倩，王麗京*（.廣東藥學院血管生物研究所，廣東 廣州 50006；.廣州醫科大學第二附屬醫院病理科，廣東 廣州 5060；.廣東藥學院基礎醫學院，廣東 廣州 50006）

·論著·

快速高效從石蠟包埋腫瘤組織中提取micro-RNA方法的研究

李江超1，楊 揚1，郝卓芳2，周曉明3，章倩倩1，王麗京1*
（1.廣東藥學院血管生物研究所，廣東 廣州 510006；2.廣州醫科大學第二附屬醫院病理科，廣東 廣州 510260；3.廣東藥學院基礎醫學院，廣東 廣州 510006）

目的探索一種從石蠟包埋組織標本中快速、便捷、低成本的提取miRNAs的方法。方法收集2年內石蠟包埋的人乳腺癌組織和保存6個月的MMTV基因工程小鼠乳腺癌組織石蠟樣本，同時選用進口A公司生產的提取石蠟組織miRNAs試劑盒作為對照；通過2種方法提取人和鼠的石蠟切片中miRNAs做對比分析，包括采用凝膠電泳驗證，檢測miRNA純度、濃度分析。為了進一步驗證其提取效果，采用定量PCR對所提取的總miRNAs進行miRNA-375和miR-218檢測。結果①采用本實驗方法從石蠟包埋乳腺癌組織中提取的miRNAs其純度在1.86～2.21OD之間，其濃度可以滿足常規實驗要求（最低38.50mg/L）；②熒光定量PCR能夠檢測到miRNA-375和miRNA-218，其拷貝數與對照組比較，2種方法差異無統計學意義（P>0.05）。③該方法提取時間短、成本低，成本是試劑盒法的1/10，提取時間至少節省1/3。結論從石蠟包埋組織標本中提取miRNAs方法切實可行，為從石蠟組織樣本提取miRNA進行分子診斷和腫瘤相關的研究提供了便利，對采用回顧性石蠟標本研究miRNAs提供了有力的幫助。

石蠟包埋組織；microRNAs;microRNA提取；乳腺癌

微小RNAs（miRNAs）是18～20bp的非編碼RNA，在轉錄水平靶向3′端UTR（非翻譯區）干擾特定基因的表達。miRNAs不同于mRNA的一個特性是不易被降解，石蠟包埋組織中miRNAs被用來做回顧性研究成為熱點，另外，miRNA在分子診斷中被關注。石蠟包埋組織是醫院最常用的保存標本方法，能夠保存多年。近年來，越來越多的研究需要從石蠟組織中提取miRNA進行研究。關于提取miRNAs的產品已經商品化，但其方法和步驟仍舊繁瑣冗長，且成本昂貴。鑒于上述問題，本研究基于miRNAs不降解特性和核酸提取原理，總結出快速、簡單提取所需石蠟組織組織中的miRNAs方法，優化了實驗步驟，加快了提取速度，降低了其成本，在臨床或科研上有著實際應用價值，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源：2010年12月—2012年12月廣州醫學院附屬第二醫院病理科收集的20例乳腺癌手術患者的石蠟標本，患者全部為女性，年齡42～53歲，平均（48.0±3.2）歲。MMTV小鼠乳腺癌石蠟標本是廣東醫學院血管生物研究所2012年9月包埋的石蠟組織。提取時，將石蠟組織進行8μm切片備用。采購的試劑盒提取作為對照，本研究所用的miRNA提取方法作為實驗組。

1.2 主要試劑和儀器：NaCl、RNA核酸收集柱購自北京天根生物技術公司，高速小型離心機、核酸蛋白濃度測量儀、miRNA石蠟組織提取試劑盒（A公司，美國）、RNA逆轉錄試劑購自廣州復能生物科技有限公司，熒光定量SYBRgreenMix試劑購自Takara公司，miRNA375和miRNA218引物以及逆轉錄購自廣州銳博生物技術有限公司。

1.3miRNA提取

1.3.1A公司試劑盒：石蠟包埋組織切取8μm切片，按照試劑盒說明書提取（本研究中簡稱方法A），具體步驟與A公司的石蠟組織miRNA提取試劑盒相一致。

1.3.2miRNA提取新方法（本研究中簡稱方法B）：①脫蠟，將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為8μm的組織片,取4片組織片置于無菌的1.5mL離心管內,加入1mL二甲苯或石蠟透明劑（上海宏茲生物公司）,漩渦振蕩混勻,55℃水浴10min,室溫條件下,12 000r/min離心3min,棄上清；加1mL無水乙醇,混勻,室溫條件下，12 000r/min離心3min,棄上清,重復操作1次,所得樣品37℃空氣干燥20min。②蛋白消化，向步驟①所得樣品中加入150μL消化緩沖液（含DNaseI酶）和10μL20mg/mL蛋白酶K,56℃水浴20min；85℃水浴10min。消化液配制，ProteinaseKbuffer250mL（1molTris-ClpH=8.0）2.5mL；0.5MEDTA（pH8.0）2.5mL；加水H2O定容至250mL）。③miRNA提取，冷卻后，繼續添加4mol的NaCl320μL，混合均勻，靜止2min。然后加入1 120μL無水乙醇，吹打均勻，RNA離心柱過濾，12 000r/min離心1min，棄上清，加80%酒精吹均勻，12 000r/min離心10min。丟上清，室溫干燥30min，20μL無核酶水溶解。④純化、收集，加40μL的90℃預熱的無核酸酶水，室溫靜置30min，12 000r/min離心1min，反復收集1次，可以提高獲得率。

1.3.3SYBRgreenqPCR：將上述2種方法提取的miRNA，按照銳博公司提供的逆轉錄引物說明書進行逆轉錄，得到的cDNA用于熒光實時定量PCR檢測。熒光定量實驗操作按照TakaraqPCRMix說明書進行。PCR擴增反應條件為94℃預變性2min，94℃40s，62℃40s，72℃30s，40個循環。使用伯樂公司的熒光定量PCR儀檢測。內參miRNA采用U6作對照。

2 結 果

2.1 瓊脂糖電泳檢測RNA的提取：使用電泳檢測方法B和方法A提取的microRNAs（miRNAs）顯示，形成彗星掃尾狀亮區條帶（圖1）。初步說明采用本方法所述可以提取到總miRNAs。對照組第1～3泳道為A方法提取、第4～6泳道為B方法提取。樣品RNA成彗星尾狀條帶，表明采用我們的方法提取到總miRNAs是可以用電泳檢測到的。

圖1 2種方法提取miRNAs凝膠電泳圖對比

M.表示相對分子質量的大小（100、250、500、750、1 000、2 000bp）；1～3.A方法提取的結果;4～6.B方法提取的結果;1～6均呈現出慧星樣電泳，表明用2%瓊脂糖電泳檢測，2種方法提取的效果無明顯差別

Figure1TheanalysisoftotalmiRNAsextractedwithtwomethodsby2%agarosegelelectrophoresis

M.indicatingM2000marker（100，250，500，750，1 000,2 000bp）;andline1-3withAmethod;whileline4-6withBmethod;Line1-6ofthemiRNAsareshowntheaboutsamesmear.TheresultsshowedthemethodBwaseffectiveandmiRNAscouldbedetectednodifferencecomparingtomethodAby2%agarosegelelectrophoresis

2.2 提取的miRNAs的質量分析：為了驗證方法B提取的miRNAs的質量，我們通過微量核酸測定儀檢測其OD值，該方法提取的microRNA，無論是MMTV基因工程鼠乳腺癌石蠟組織還是人的乳腺癌石蠟組織，通過紫外分光光度計檢測OD值以及計算260/280比值，結果提示其濃度完全可以滿足PCR逆轉錄的需要（10ng～1μg）260/280比值>1.8，說明所提取的miRNAs在正常范圍（OD值在1.8～2.2之間屬于正常范圍）。其石蠟標本的時間從2個月或2年的標本均可以滿足需要，見表1。

表1 核酸檢測儀檢測的miRNA的純度和濃度Table 1 The quality test of miRNAs extracted from MMTV mice paraffin samples and human breast cancer tissue by nucleic acid detector

2.3 提取的miRNAs可以用于特異性引物的檢測：上述已經對該方法提取的miRNA質量進行檢測，為了進一步檢測該方法提取的miRNA是否可以特異性的應用于熒光定量PCR，對8個患者乳腺癌組織中的U6和miRNA-218進行驗證，通過定量PCR分析，可以從圖2中發現，其溶解曲線比較整齊，說明是引物特異性擴增，用方法B提取的miRNAs進行熒光定量PCR，所得miRNA均可以檢測到內參U6和miR218的表達，其RT-PCR的融解曲線特異性好并且CT值接近。說明本方法能夠取得miRNA可以應用于特異性引物的定量PCR檢測。

圖2 采用方法B從石蠟組織標本中提取的miRNA可以滿足miRNA熒光定量的檢測

采用方法B所獲得的miRNA通過RT-PCR實驗，可以檢測到U6和miRN218，并且溶解曲線顯示出引物的特異性

Figure 2 miRNAs extracted from paraffin tissue samples met the requirement of detection of miRNA by quantitative RT-PCR

miRNA obtained from B method could be detected the expression of U6,and miRNA-218 expression level also could be detected with RT-PCR and solubility curve illustrated the primers were specific

2.4 提取的microRNA閾值的檢測：上述實驗證明特異性引物從所提取的miRNAs可以擴增出目的基因，為了驗證采用方法B所提取的miRNA和國外進口試劑盒提取的miRNA效率的差異，檢測了相同的8個標本的miRNA-218和miRNA-375表達量的變化，U6作為內參，分別對其逆轉錄后進行熒光定量PCR檢測。結果顯示，2種方法提取的miR218和miR375差異無統計學意義，見表2。

GroupsmiRNA?218miRNA?375MethodA18．31±2．8923．10±3．22MethodB18．44±3．5724．51±2．79t0．0800．936P0．9370．365

2.5 2種miRNA提取方法的經濟和效率的對比：方法B經濟，成本大約每樣品7.0元，而進口試劑盒每個樣品是70元；提取周期B方法是2～2.5h，而進口試劑盒的A方法時間大約是5～6h。B方法費用是進口試劑盒的1/10，而時間也大約節省了2/3。

3 討 論

在腫瘤研究中，回顧性實驗研究必不可少，最豐富而又最容易獲得的是石蠟包埋保存的腫瘤組織。而優化和簡化從石蠟標本中提取miRNA的方法，對有效利用這些寶貴的臨床資源進行深入研究有著重要意義[1-3]。

目前，提取miRNA多依賴進口試劑盒。國內也有部分廠家在生產miRNA提取試劑盒，本研究正是在實踐的基礎上，總結得出一種實用、節約時間、低成本的miRNA提取方法，主要針對石蠟組織的miRNA提取。本研究實驗所需的各種試劑都是常規實驗室的試劑，可以隨時配制，成本低，取材方便。同時，本研究在提取MMTV小鼠[4]和人的標本中，差異無統計學意義，表明該方法提取的miRNA可以用于后續實驗研究。也說明該方法小鼠和人的種屬差異影響不大，通過同進口試劑盒作對比可見，本法提取的miRNA質量在正常范圍之內，且定量PCR檢測其溶解曲線，提示用其擴增miRNA具有一定特異性。為了驗證實驗的可用性和提取效率，又經逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcripatse polymerase chain reaction,RT-PCR）驗證其拷貝數變化，結果顯示2種方法提取的miRNA中miRNA-218和microRNA-375的表達差異均無統計學意義[5-7]。該方法提取的石蠟樣本中miRNA能夠用于后續的RT-PCR實驗。

石蠟標本在病理科是最重要的材料和患者檔案，在回顧性或總結性研究中有著極其重要的作用，很多醫院都建立了大量的存檔福爾馬林固定石蠟包埋樣本庫，為科研提供了有力的研究工具。然而，石蠟包埋樣本RNA的提取存在一定難度，主要與甲醛固定、保存時間與條件等因素相關，導致RNA部分降解。目前已有眾多學者針對樣本的固定時間、不同固定劑、保存方法等方面研究對RNA分子的影響[8-11]。miRNA不易降解，對充分應用這些材料提供了依據。目前，提取miRNA的步驟多且成本高，對可行前瞻性或回顧性研究產生不利的影響。所以，新的提取技術能夠補充原有的技術，加快提取速度，節約成本，為有效利用并預測預后的miRNA表達提供幫助。同時，miRNA的鑒別與臨床特征、預后及篩選出相關靶向分子或調控異常路徑等都有重要關系[12-14]。

綜上所述，本研究所述新方法為今后開展大量FFPE樣本提取miRNA進行分子生物學研究提供了實驗依據。誠然，本方法尚需要進一步完善，以便更好地為臨床和腫瘤研究提供幫助。

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（本文編輯：許卓文）

ANEFFICIENTANDRAPIDMETHODFORMICRORNAFROMPARAFFIN-EMBEDDEDTUMORTISSUE

LIJiangchao1,YANGYang1,HAOZhuofang2,ZHOUXiaoming3,ZHANGQianqian1,WANGLijing1*
（1.VascularBiologyResearchInstitute,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2.DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou
510260,China;3.BasicMedicalCollegeofGuangdongPharmacyCollege,Guangzhou510006,China）

ObjectiveTolookforbetterandlowcostmethodforextractingmicroRNAs（miRNAs）fromparaffin-embeddedtissueformiRNAdiagnosisorothermiRNAsassay.MethodsThesampleswerecollectedfromparaffin-embeddedhumanbreastcancertissuestoredovertwoyearsandMMTVtransgenicmouseparaffin-embeddedbreasttissueoversixmonths.ThemiRNAsextractparaffintissuekitservedascontrol.TodetectthequalityofmiRNAsobtainedbythesetwomethods,used2%gelelectrophoresisandtheODvaluetoconfirmthequalityandconcentration.Furthermore,verifiedmiRNAsbytestingmiRNA-375andmiRNA-218withquantitativePCR.Results①miRNAsextractedbyourmethodmettheexperimentalrequirements（A260/280=1.86-2.21OD）,andthelowestconcentrationwas38.50mg/L.②ThequantitativePCRcandetectmiRNAsanditscopiesnumbercomparedwiththecontrol，thedifferencewasnosignificant（P>0.05）.③Thismethodhasrelativelylowercost,about1/10costofkitmethod,whiletheextractionprocessdecreasedabout1/3time.ConclusionThemethodweoptimizedforextractedmiRNAsfromparaffin-embeddedtissueisfeasible,itprovidesaconvenientexperimentalmethod,andabetterapproachtodetectmoreretrospectivespecimensofparaffin-embeddedtissuesamples.

paraffin-embeddedtissue;microRNA;extraction;breastcancer

2013-08-01；

2013-09-10

國家自然科學基金項目（31271455）；廣東省自然科學

基金項目（S2012040007658）；廣東省醫學科研基金項目（A2013312）

李江超（1976-），男，河北晉州人，廣東藥學院血管生物研究所助理研究員，理學博士，從事腫瘤學基礎研究。

R737.9

A

1007-3205（2014）05-0541-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.015

*通訊作者