三參方對慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織細胞凋亡及相關基因蛋白表達的影響

喬曉溫，劉連臣，張彩俠，潘麗蘭，李光榮，薛偉彩（.河北省辛集市中醫院兒科，河北 辛集 060；.河北省任丘市衛生學校中醫教研室，河北 任丘060；.河北省遷西縣人民醫院外科，河北 遷西0600；.河北工程大學附屬醫院兒科，河北 邯鄲 0600；.河北省優撫醫院內科，河北 石家莊 000；6.河北中醫學院附屬醫院肛腸科，河北 石家莊000）

·論著·

三參方對慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織細胞凋亡及相關基因蛋白表達的影響

喬曉溫1，劉連臣2，張彩俠3，潘麗蘭4，李光榮5，薛偉彩6*
（1.河北省辛集市中醫院兒科，河北 辛集 052360；2.河北省任丘市衛生學校中醫教研室，河北 任丘062550；3.河北省遷西縣人民醫院外科，河北 遷西064300；4.河北工程大學附屬醫院兒科，河北 邯鄲 056002；5.河北省優撫醫院內科，河北 石家莊 050051；6.河北中醫學院附屬醫院肛腸科，河北 石家莊050011）

目的探討三參方治療慢性萎縮性胃炎的作用機制。方法將實驗大鼠60只隨機分為正常組、模型組、三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組、三九胃泰組各10只，采用復合因素造模法復制大鼠慢性萎縮性胃炎模型，觀察各組大鼠胃組織病理形態學、胃組織細胞凋亡，相關基因Caspase-3、Bcl-2和Fas蛋白表達的變化。結果模型組大鼠胃組織細胞凋亡指數（apoptotic index,AI）明顯升高,Caspase-3和Fas蛋白表達增強,Bcl-2蛋白表達減弱；三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能降低AI（P<0.01）；各治療組均能升高G2/M 、S期百分數和細胞增殖指數（proliferation index，PI）（P<0.05）；三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能降低Caspase-3 PI和Fas免疫熒光指數（fluorescence index,FI）（P<0.05）；三參方高劑量組降低Fas FI較維霉素組和三九胃泰組更多（P<0.05）。結論三參方可通過調控Caspase-3、Bcl-2和Fas蛋白的表達，降低胃組織細胞凋亡率，該方可用于治療慢性萎縮性胃炎。

胃炎,萎縮性；疾病模型，動物；細胞凋亡；基因

三參方為經多年臨床篩選出的治療慢性萎縮性胃炎（chronic atroghic gastritis,CAG）的經驗方，具有益氣養陰、柔肝健脾之功，取得了較好的臨床療效。實驗表明，三參方能夠促進胃動素和胃泌素的分泌釋放，對胃黏膜具有保護作用[1-3]，本研究采用流式細胞術（flow cytometry，FCM）觀察三參方對CAG大鼠胃組織細胞凋亡、增殖及其相關調控基因Caspase-3、Bcl-2和Fas基因蛋白表達的影響，以研究三參方在治療CAG方面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源：Wistar大鼠，60只，雄性，體質量180～200g，購自河北省實驗動物中心（合格證號：冀動字1001005）。

1.2 藥物、試劑和儀器：三參方藥物組成，黨參、丹參、玄參、炒白芍、炒白術、炙甘草、清半夏、黃連、丁香、陳皮等，采用水煎和醇提取相結合方法，將提取液分別濃縮為含生藥0.367g/mL、0.183g/mL濃度的水溶液。三九胃泰膠囊和維霉素片均用蒸餾水制成0.1g/mL濃度的混懸液。脫氧膽酸鈉購自北京奧博星生物技術有限公司。Fas、Bcl-2和Caspase-3一抗單克隆抗體、二抗工作液（羊抗鼠PITC-IgG熒光抗體）均由美國Santa Cruz公司提供。Epics-XLⅡ型流式細胞儀由美國Beckman Coulter公司生產。

1.3 動物分組與造模：將實驗大鼠常規喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、維霉素組、三九胃泰組、三參方低劑量組、三參方高劑量組，共計6組，每組10只。動物造模參照相關文獻采用的方法[4]，即先灌飼0.2%脫氧膽酸鈉溶液，每只用量為1.5mL/d，5h以后，再灌飼50℃熱水，每只用量為2mL/d，同時加用饑飽失常的喂養方法（2d足量喂食，1d停食），正常組大鼠普通飼料喂養，每天灌飼等量的蒸餾水，造模時間共8周。

1.4 給藥方法：造模成功后，開始灌胃治療，其中三參方低劑量組和高劑量組分別按照1.83g/kg、3.67g/kg的劑量灌胃，維霉素組和三九胃泰組均按照1g/kg的劑量灌胃，正常組和模型組均給予等劑量的蒸餾水灌胃；1次/d，用藥體積均按照1mL/100g計算。

1.5 胃組織樣本制作：治療5周后，麻醉實驗大鼠，股主動脈取血后，迅速剖開腹部，分離胃組織，沿胃竇近幽門口至胃大彎方向取適量的胃組織，于生理鹽水中沖洗后，以70%乙醇溶液固定，置于冰箱中冷藏待檢。

1.5.1 制備單細胞懸液：將固定的胃組織放置于100目的不銹鋼網上，網下置一平皿，用剪刀剪碎至1mm3大小，再用眼科鑷子輕搓組織塊，邊搓邊以PBS液沖洗，直至將組織搓完。然后將平皿中的混懸液，用300目篩網過濾以去除細胞團塊，收集細胞懸液，500～800r/min離心2min，棄去上清，保留沉淀，加入PBS 0.3mL，稀釋混勻后，將單細胞懸液分成4份，調整每份的細胞數為1×106，分別用于檢測細胞凋亡，以及Caspase-3、Bcl-2和Fas蛋白表達。

1.5.2 細胞凋亡DNA含量染色：取1×106細胞懸液0.1mL，加入10%雞紅細胞作為內參標準，與樣品同步染色，加入碘化丙啶1mL，在4℃冰箱染色30min，以500目銅網過濾，上機檢測。

1.5.3 Caspase-3、Bcl-2、Fas蛋白免疫熒光標記：將鼠抗人單克隆抗體工作液0.1mL，加入到單細胞懸液1×106/mL中，室溫孵育30min，加入PBS 10mL洗滌1次，棄去上清液，加入羊抗鼠PITC-IgG二抗工作液100μL，室溫孵育30min，加入PBS 10mL離心，棄去上清，除去未結合的熒光二抗，再加入PBS 0.1mL并用500目的銅網過濾后，即可上機檢測。在對蛋白免疫熒光標記物測定時，設一抗或二抗的本底作為對照和陰性對照。

1.5.4 檢測方法：應用Epics-XLⅡ型流式細胞儀，檢測前以flow-check TMF luorpheres（10μm）熒光微球作為標準樣品調整儀器變異系數在2%以內。

1.6 測量資料分析方法：應用MuticycleAV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析，應用Expo32ADC進行免疫熒光數據分析，以細胞凋亡指數（apoptotic index，AI）表示細胞凋亡程度，細胞增殖指數（proliferation index，PI）代表細胞的增殖活性，免疫熒光指數（fluorescence index，FI）表示蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組對CAG大鼠胃組織細胞凋亡的影響：與正常組比較，模型組AI明顯升高（P<0.01）；G2/M期、S期細胞百分率和PI明顯降低（P<0.01）；三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能降低AI（P<0.01），三參方高劑量組降AI值最多，維霉素組降AI值最少，但各治療組之間差異無統計學意義；各組對升高G0/G1的影響差異無統計學意義（P>0.05）；各治療組均升高G2/M、S期百分數和PI值（P<0.05），各治療組之間對G2/M和PI值的影響差異無統計學意義（P>0.05），但三九胃泰組對升高S期百分數不如三參方低劑量組（P<0.05）。見表1。

組別AIG0/G1（%）G2/M（%）S（%）PI正常組10．31±1．5175．68±6．249．51±0．6614．42±1．5523．96±2．46模型組24．46±3．12?80．89±8．857．73±0．88?11．28±0．92?18．96±1．83?三參方高劑量組14．55±2．78?#73．21±7．7111．55±1．75?#15．16±1．16#26．59±2．37#三參方低劑量組15．84±3．03?#74．48±8．9211．41±1．92?#15．38±0．52#26．81±3．02#維霉素組17．83±2．89?#75．83±6．8410．82±1．52?#14．18±1．73#24．92±2．63#三九胃泰組17．41±3．88?#75．49±5．6511．16±1．28?#13．69±0．88#△24．89±1．13# F24．9211．23111．09515．22415．176 P0．0000．3070．0000．0000．000

*P<0.05與正常組比較 #P<0.01與模型組比較 △P<0.05 與三參方高劑量組比較（SNK-q檢驗）
AI：apoptotic index；PI：proliferation index

2.2 各組對CAG大鼠胃組織細胞Caspase-3、Bcl-2、Fas蛋白表達的影響： 與正常組比較，模型組大鼠Caspase3 FI和Fas FI均升高（P<0.05），而Bcl-2蛋白表達FI值降低（P<0.05），三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能降低Caspase-3 FI和Fas FI（P<0.05）；三參方高劑量組降低Fas FI較維霉素組和三九胃泰組更多（P<0.05）；三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能升高Bcl-2 FI，各治療組間差異無統計學意義（P>0.05），但三參方高劑量組最接近正常組。見表2。

組別Caspase?3FIFasFIBcl?2FI正常組1．03±0．010．83±0．131．0±0．15模型組1．32±0．03?1．28±0．21?0．74±0．21?三參方高劑量組1．06±0．02?#0．89±0．12?0．98±0．19#三參方低劑量組1．07±0．03?#1．08±0．23?0．95±0．11#維霉素組1．18±0．03?#△1．12±0．21?△0．92±0．08#三九胃泰組1．16±0．02?#△1．06±0．18?△0．97±0．11# F192．4447．7664．099 P0．0000．0000．003

*P<0.05 與正常組比較 #P<0.01與模型組比較 △P<0.05與三參方高劑量組比較（SNK-q檢驗）
FI：fluorescence index

3 討 論

中醫學中無CAG的病名，根據其臨床表現可歸屬于中醫的“胃痞、胃脘痛”等疾病范疇[5]，究其病因多是由于飲食不節、饑飽寒溫失常，或郁怒傷肝、所欲不遂、肝失疏泄、克伐脾胃，或操勞過度、調攝失宜、損傷脾胃等，漸致脾胃氣虛陰虧，氣機失于調暢。本病的病位雖在胃，但脾與胃相為表里，相互為用，功能緊密相關；肝司疏泄之職，有助脾胃氣機的升降。在治療上既要注意健脾和胃、益氣養陰，又要注意疏暢肝氣。故三參方中選用黨參、炒白術補氣健脾；玄參濡養胃陰；炒白芍、炙甘草酸甘化陰，柔肝和胃；陳皮、丹參調暢胃經氣血；清半夏、丁香、黃連辛開苦降，通降胃氣。諸藥合用，脾胃得鍵，氣陰得充，氣機得暢，故治療CAG可獲得滿意的療效。

本研究中模型組大鼠AI值、Caspase-3 FI和Fas FI明顯升高，G2/M、S、PI和Bcl-2 FI明顯降低，三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能降低模型組的AI，但以三參方高劑量組降低AI效果最好；三參方高劑量組、三參方低劑量組、維霉素組和三九胃泰組均能升高模型組G2/M、S、PI，但最接近正常組的是維霉素組，以三參方高劑量組升高G2/M的最多，三參方低劑量組升高S和PI最多，各組對G0/G1的影響不大；各治療組均能降低Caspase-3 FI和Fas FI，升高Bcl-2 FI，但最接近正常組的是三參方高劑量組。

胃組織細胞的過度凋亡，可嚴重影響胃的生理功能。Bcl-2與Fas是與細胞凋亡關系較為密切的基因，兩者的作用各不相同。Bcl-2基因主要作用是通過抗細胞凋亡，以延長細胞壽命，促進細胞生存[6-8]。Fas基因為細胞膜表面受體蛋白，它是與T淋巴細胞膜上Fas-L結合，向細胞內傳遞“死亡信號”，誘導靶細胞發生凋亡[9]。Caspase-3是Caspase家族成員之一，是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，Caspase-3介導的凋亡在人體多種類型細胞中普遍存在，其降解凋亡標志性底物的活性最強；Caspase-3可被該家族其他成員如Caspase-9和Caspase-6激活。Bcl-2，Bcl-xL等抗凋亡蛋白可通過與Fas等促凋亡蛋白形成異二聚體阻止線粒體釋放細胞色素C，或直接與a-paf-1、Caspase-9結合成三元復合物從而阻止Caspase-9途徑的激活，Caspase-3不能被活化，因而細胞凋亡受抑制[10]。本研究結果表明，模型組大鼠的胃組織中細胞凋亡率最高，同時Bcl-2表達量最低，Caspase-3和Fas表達量最高；說明Caspase-3和Fas表達上調、Bcl-2表達下調，是造成細胞凋亡增加的原因之一。經藥物治療后，與模型組相比，各治療組Caspase-3和Fas表達量明顯降低，Bcl-2表達量明顯增加，細胞凋亡率明顯下降；說明三參方能夠加速胃組織細胞的DNA合成及分裂增殖，抑制胃組織細胞過度凋亡，以保證胃組織細胞的正常功能，從而達到抗CAG的作用，此可作為三參方治療CAG的作用機制之一。

[1] 屈樹行,張治秋,高瑋,等.三參方對慢性萎縮性胃炎大鼠治療作用的實驗研究[J].河北中醫藥學報,2011,26（3）：5-6.

[2] 李光榮，楊劍，屈樹行，等.三參方對慢性萎縮性胃炎大鼠血漿ET-1和6-K-PGF1α含量的影響[J].河北中醫藥學報，2012，27（3）：3-4.

[3] 謝晶日，葛陽，張楊.欣胃顆粒對慢性萎縮性胃炎大鼠血清胃泌素的影響[J].中醫藥學報，2013,41（3）：88-89.

[4] 李紅平，毛萬姬，鄒學正.丹白麥門冬湯對慢性萎縮性胃炎大鼠胃粘膜病理形態學的影響[J].陜西中醫，2007，28（2）：243-245.

[5] 朱林蘋，林壽寧，韋維.安胃湯對慢性萎縮性胃炎模型大鼠EGF EGFR mRNA表達的影響[J].四川中醫，2012,30（6）：45-48.

[6] LALIER L,CARTRON PF,JUIN P,et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis,2007,12（5）:887-896.

[7] 吳繼雄，鄧亞芳，方亮.慢性萎縮性胃炎患者體內NF-κB和Bcl-2的表達及意義[J].海南醫學院學報，2013,19（7）：895-897，900.

[8] 趙鵬，譚明義，王新芳.譚氏萎胃方治療慢性萎縮性胃炎及其對細胞凋亡因子影響的研究[J].中國中醫藥現代遠程教育，2013,11（13）：158-159.

[9] LOCKSHIN RA.Programmed cell death:history and future of aconcept[J].J Soc Biol,2005,199（3）:169-173.

（本文編輯：許卓文）

2013-11-18；

2014-04-13

喬曉溫（1979-），女，河北辛集人，河北省辛集市中醫院主管護師，從事兒科疾病護理研究。

R573.32

B

1007-3205（2014）05-0561-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.021

*通訊作者