肝臟去交感神經狀態對大鼠脂類和激素代謝的影響

宦宏波,夏 鋒,吳 林,吳黎靂,鄧 翔,馬寬生,別 平

(第三軍醫大學西南醫院全軍肝膽外科研究所,重慶,400038)

肝臟擁有廣泛的神經纖維分布，相關研究[1-3]表明，這些神經纖維在肝臟的生理病理過程中將會發揮重要的調控功能。交感神經是自主神經中重要的組成部分，對肝臟的生理功能具有重要的調控作用，目前有研究[4-6]表明刺激肝臟神經支可引發血糖、肝血流量的變化等。肝臟周圍的韌帶中分布有大量支配肝臟的神經纖維，其中含有很多交感神經纖維，肝臟外科手術中常會大范圍地游離這些韌帶，也必然會損傷肝臟的神經叢，從而導致肝臟的去神經狀態[7]。同時，肝臟外科手術可因對肝臟的直接創傷和缺血再灌注損傷等造成肝組織的急性損害。作者前期研究證實，肝損傷情況下去交感神經狀態有利于蛋白合成、膽紅素代謝、能量代謝和排泄功能,同時也使低血鉀的程度減輕[8-9]。在肝臟去神經狀態下，是否對肝臟脂類和激素的代謝產生影響，目前鮮有報道。本實驗應用大鼠急性肝損傷模型模擬臨床外科手術對肝臟的急性損傷，應用去交感神經動物模型模擬臨床外科手術中游離肝周韌帶致去交感神經狀態，探討此時大鼠肝臟的脂類和激素代謝在正常和化學性急性肝損傷不同情況時的變化，以了解去交感神經狀態對肝臟脂類和激素代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)(Sigma,美國),CCl4(重慶化學試劑公司)，血清皮質醇(Cor)放射免疫分析試劑盒(3V診斷技術公司)，血漿醛固酮(ALD)放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術研究所)，免疫活性胰島素IRI放射免疫分析試劑盒(成都華西糖尿病科技開發研究所)，甘油三酯(TG)試劑盒(氧化酶法)，膽固醇(Tch)試劑盒(氧化酶法)均購自上海科華東菱診斷用品有限公司。全自動生化分析儀Synchron CX7 (Beckman)。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性Wistar大鼠共80只，體質量180～220 g,均由第三軍醫大學實驗動物中心提供。按照隨機數字表法分成4組，每組20只。A: 對照組，麻醉狀態下于大鼠腹部切一長約1 cm的小口隨即縫合; B: 肝損傷模型組，大鼠按0.4 mL/100 g的劑量于腹部皮下多點注射60% CCl4(CCl4和滅菌液狀石蠟之比為6∶4),在實驗后第4天追加注射1次; C: 去交感神經模型組，參考文獻[11]的方法建立去交感神經動物模型; D: 實驗組，先建立交感神經動物模型，再按肝損傷模型組方法注射60% CCl4。所有大鼠于實驗后第7天由腹主動脈抽血2～3 mL,離心取上清,-20 ℃保存備用。

1.3 肝臟去交感神經狀態動物模型建立

參考文獻[11],6-OHDA用滅菌生理鹽水配制成100 mg/L的溶液(現用現配)。Wistar大鼠行乙醚吸入麻醉，固定于大鼠手術板上。大鼠腹部局部消毒，于腹部正中做切開一長約1 cm縱向切口，用鑷子輕輕夾出小腸，理出空腸段系膜，找到腸系膜血管，用4號半頭皮針刺入腸系膜靜脈中，注入2 mL 6-OHDA(含200 μg)。注射完畢后用棉簽壓迫針眼約3～5 min后，止血后還納腸道，縫合腹壁，常規飼養[10-11]。

1.4 肝臟脂類的檢測

取冷凍保存的血清，應用甘油三酯和膽固醇試劑盒在全自動生化分析儀Synchron CX7(Beckman)上進行檢測。

1.5 應用放射免疫法測定激素代謝的變化

1.5.1 血清皮質醇(Cor)檢測：檢測步驟按照試劑盒說明書進行。A: 取8支離心管，分為4組，每組2支，分別標注非特異結合管(NSB)、零結合管(So)、標準管(S1-S6)、樣本管(U); B: 向NSB管加入150 μL零標準，向So管加入50 μL零標準，向標準管和樣本管分別加入50 μL相對應的標準品或樣本; C: 所有試管中加入100 μL125I-皮質醇，再向除NSB離心管外的其他試管中加入100 μL皮質醇抗體，振蕩搖勻; D: 37 ℃溫育1 h,然后4 ℃放置0.5 h。再向所有的試管中加入1 000 μL分離劑，振蕩搖勻; E: 4 ℃放置15 min; F: 檢測放射性計數，取其平均計數為總放射性計數。3 500 rpm離心20 min,棄上清，測沉淀放射性計數。結果計算：按下列公式分別計算出NSB、So、S1-S6及U各管的結合率:

B為每組試管計數的均值,B0為零結合管計數的均值,NSB為非特異管兩管計數的均值。非特異結合率和最大結合率分別為: NSB/T,B0-NSB/T,其中T、B0、NSB為扣除本底的凈計數。以各標準管的B/B0%為縱坐標，以皮質醇標準濃度為模坐標，在Logit-Log雙對數坐標紙上做標準曲線。根據待測樣本的結合率，從標準曲線上查出相應的皮質醇含量。

1.5.2 血清醛固酮(ALD)檢測：檢測步驟按照試劑盒說明書進行。操作基本步驟同上，本方法用ANS為阻斷劑，使標本內的醛固酮呈游離狀態存在。

1.5.3 免疫活性胰島素(IRI)檢測：檢測步驟按照試劑盒說明書進行。試劑配制方法：胰島素標準品S0用1.0 mL蒸餾水溶解，其他試劑用0.5 mL蒸餾水溶解，充分混勻使用，濃度分別為0、5、10、20、40、80和160 mIU/L(相當于0、0.0323、0.0626、0.125、0.25、0.5及1.0 nmol/L)。抗胰島素抗體用10 mL蒸餾水溶解，充分混勻后使用。125I單碘胰島素用10 mL蒸餾水，充分混勻后使用。質控血清分別用0.5 mL蒸餾水溶解，充分混勻。與樣品一樣投入測定。復合分離劑用前必須充分振搖，并且邊搖邊加。操作程序同上。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 去交感神經狀態對脂代謝的影響

圖1 不同處理組7 d后血清中TG的含量

圖2 不同處理組7 d后血清中Tch的含量

2.1.1 各組TG的檢測結果：肝損傷模型組血清TG為(0.87±0.09) μmol/L,較對照組(1.22±0.18) μmol/L明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05); 實驗組TG(1.05±0.04) μmol/L與肝損傷模型組相比有上升趨勢；單純去交感神經組血清TG含量與對照組相比無明顯差異。見圖1。

2.1.2 各組Tch的檢測結果：肝損傷模型組Tch(1.47±0.21) μmol/L,去交感神經組Tch(1.79±0.38) μmol/L較對照組(2.37±0.29) μmol/L相比明顯下降(P<0.05),實驗組Tch(1.96±0.06) μmol/L較肝損傷組有明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.2 去交感神經狀態對激素代謝的影響

圖3 不同處理組7 d后血清中Cor的含量

圖4 不同處理組7 d后血清中ALD的含量

2.2.1 去交感神經對Cor代謝影響的檢測結果：實驗組和肝損傷模型組的Cor分別為(20.9±4.2) μg/L和(28.3±5.6) μg/L,實驗組血清Cor含量較肝損傷模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05; 但較對照組(9.5±3.4) μg/L,明顯升高(P<0.05); 而去交感神經組Cor(9.1±3.2) μg/L與對照組相比無差異。見圖3。

2.2.2 去交感神經對ALD代謝影響的檢測結果：實驗組和肝損傷模型組的ALD分別為(471.73±72.9) ng/L和(651.6±82.3) ng/L,實驗組血清ALD含量較肝損傷模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05); 但較對照組(196.5±47.3) ng/L明顯升高(P<0.05); 而去交感神經組ALD(209.1±47.5) ng/L與對照組相比無差異。見圖4。

2.2.3 去交感神經對IRI代謝影響的檢測結果：對于免疫活性胰島素(IRI),實驗組(29.39±7.67) mIU/L、去交感神經組(18.79±4.69) mIU/L和肝損傷模型組的(20.37±5.57) mIU/L與對照組(12.48±3.03) mIU/L比較均明顯升高(P<0.05),而且實驗組IRI較肝損傷組與去交感神經組均明顯升高，差異有統計學差異(P<0.05)。見圖5。

3 討 論

圖5 不同處理組7 d后血清中IRI的含量

肝臟是人體最重要的器官之一，具有多種多樣的代謝功能，對糖、脂類、蛋白質、維生素和激素等的代謝均有重要作用[12]。肝臟功能受體液和神經2大作用方式的調節，已有文獻報道，刺激肝臟交感神經可引起代謝方面的多種變化[13-14]。作者前期的研究以及相關報道證實，刺激肝臟交感神經可引起血糖升高和肝血流量的減少[15-16]。Martin等[17]研究證實，刺激游離的灌流肝臟交感神經可引起乳酸釋放，尿酸鹽和尿素的形成，減少酮體和尿酸的釋放和氨的攝取。另外，刺激交感神經還可引起肝內血流動力學的改變，使肝竇閉塞等。總之，神經調節對肝臟的各項功能有著重要的調節作用。在CCl4引起的急性肝損傷的情況下,Iwai等[18]報道交感神經興奮可加重肝損傷的程度。夏鋒等[8]研究報道證實了化學性去交感神經有利于減輕CCl4致肝損傷程度，促進肝臟蛋白的合成、膽紅素的代謝、能量的代謝和排泄功能,同時也使低血鉀程度減輕。本研究中化學性去除交感神經能改善CCl4所致急性肝損傷時肝臟對脂類的合成功能和對激素的滅活功能，為證實去除交感神經能改善急性肝損傷時肝臟代謝等生理功能提供了更多佐證，這與已有的研究結果一致。

肝臟是脂類代謝的主要器官，脂肪不斷地被水解成甘油和脂肪酸而進入血液，進而運送至肝臟進行代謝。在肝臟病變嚴重時，肝臟對甘油三酯的合成功能受損，不能將攝入的脂肪酸合成甘油三酯輸出，導致血漿脂肪酸的含量增高，而甘油三酯反而下降[19]。本研究中，急性肝損傷后血清甘油三酯和膽固醇均下降，是由于CCl4造成急性肝損傷，使肝臟對脂類合成的功能受損，使得轉運出肝臟的脂類減少。單純去除交感神經后，甘油三酯變化與對照組無差異，而膽固醇較對照組明顯下降，可能是由于兒茶酚胺可增加β-羥-β甲-戊二酸單酰CoA還原酶(HMGCoA還原酶)的合成，而該酶是膽固醇合成的限速酶，去除交感神經后，減少了兒茶酚胺類激素的含量，使得HMGCoA還原酶合成減少，最終使得膽固醇合成降低。在急性肝損傷的基礎上去除交感神經，使血液中甘油三酯、膽固醇含量較單純肝損傷組有所上升，是由于急性肝損傷后去除交感神經能夠改善肝臟功能，促進其合成功能有所恢復。

肝臟是降解滅活類固醇激素的主要器官。皮質醇和醛固酮等皮質激素在肝細胞內主要經過還原、羥化、側鏈裂解、氧化及結合酯化5個反應步驟而失去基本的活化基團，經膽汁及尿液排出。當肝細胞功能受損時則激素的降解滅活過程受阻，從而使皮質激素濃度升高。本研究中單純CCl4致肝損傷組皮質醇和醛固酮的含量較對照組均明顯升高，這是由于肝損傷后，激素在肝細胞降解滅活的過程受到影響，皮質激素不能在肝臟滅活，使得皮質激素的濃度升高。實驗組中皮質激素含量較肝損傷組明顯下降，則是由于去除交感神經后，肝臟的功能得到一定程度的恢復，肝細胞對皮質激素的滅活作用也得到了改善。

本實驗中肝損傷組胰島素明顯升高，是由于胰島素的滅活也在肝臟內完成，肝損傷后滅活作用減弱，使得胰島素濃度升高。同時胰島素的分泌亦受到自主的神經調節，α腎上腺素能興奮劑腎上腺素和去甲腎上腺素等能夠抑制胰島素的分泌，因此實驗中去除交感神經亦有可能去除了調控胰腺的交感神經，使抑制胰島素分泌的因素減少，最終使胰島素含量較對照組明顯升高，且在急性肝損傷后，滅活作用的減弱和胰島素分泌的增多，使實驗組胰島素濃度明顯升高。

綜上所述，本實驗通過構建急性肝損傷模型和化學性去交感神經模型，了解化學性去交感神經對急性肝損傷后大鼠肝臟脂類和激素代謝的影響，結果證實：去交感神經狀態能夠促進肝損傷時肝臟脂類合成功能和激素代謝功能的改善，促進急性肝損傷時肝臟功能的恢復。

[1]Dicostanzo C A,Dardevet D P,Neal D W,et al.Role of the hepatic sympathetic nerves in the regulation of net hepatic glucose uptake and the mediation of the portal glucose signal[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,290(1): E9.

[2]Puschel G P.Control of hepatocyte metabolism by sympathetic and parasympathetic hepatic nerves[J].Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol,2004,280(1): 8548.

[3]Andrews W H,Orbach J.Sodium receptors activating some nerves of perfused rabbit livers[J].Am J Physiol,1974,227(6): 1273.

[4]Geary N,Sauter J L,Noh U.Glucagon acts in the liver to control spontaneous meal size in rats[J].Am J Physiol,1993,264(1 Pt 2): R116.

[5]Henderson J M,Mackay G J,Lumsden A B,et al.The effect of liver denervation on hepatic hemodynamics during hypovolemic shock in swine[J].Hepatology,1992,15(1): 130.

[6]Nogueiras R,Tschop M H,Zigman J M.Central nervous system regulation of energy metabolism: ghrelin versus leptin[J].Ann N Y Acad Sci,2008,1126(14/19): 125.

[7]Moghimzadeh E,Nobin A,Rosengren E.Adrenergic nerves and receptors in the liver[J].Brain Res Bull,1982,9(1/6): 709.

[8]夏鋒,何振平,李昆,等.去交感神經狀態對大鼠肝功能的影響[J].第三軍醫大學學報,2004,26(3): 230.

[9]Xia F,He Z,Li K,et al.Evaluation of the role of sympathetic denervation on hepatic function[J].Hepatol Res,2006,36(4): 259.

[10]Lackovicova L,Banovska L,Bundzikova J,et al.Chemical sympathectomy suppresses fibrosarcoma development and improves survival of tumor-bearing rats[J].Neoplasma,2011,58(5): 424.

[11]夏鋒,何振平,董家鴻,等.去交感神經狀態對肝切除后肝再生的影響[J].第三軍醫大學學報,2001,23(4): 416.[12]Lautt W W.Afferent and efferent neural roles in liver function[J].Prog Neurobiol,1983,21(4): 323.

[13]NParfenova N S.The liver and the nervous system[J].Biomed Khim,2004,50(2): 136.

[14]Chida Y,Sudo N,Takaki A,et al.The hepatic sympathetic nerve plays a critical role in preventing Fas induced liver injury in mice[J].Gut,2005,54(7): 994.

[15]Ramnanan C J,Edgerton D S,Cherrington A D.Evidence against a physiologic role for acute changes in CNS insulin action in the rapid regulation of hepatic glucose production[J].Cell Metab,2012,15(5): 656.

[16]Perseghin G,Regalia E,Battezzati A,et al.Regulation of glucose homeostasis in humans with denervated livers[J].J Clin Invest,1997,100(4): 931.

[17]Martin D D,Cincotta A H,Meier A H.Hepatic vagotomy abolishes the circadian rhythm of lipogenic responsiveness to insulin and reduces fat stores in hamsters[J].Neuroendocrinology,1990,52(1): 9.

[18]Iwai M,Shimazu T.Exaggeration of acute liver damage by hepatic sympathetic nerves and circulating catecholamines in perfused liver of rats treated with D-galactosamine[J].Hepatology,1996,23(3): 524.

[19]Pinzani M,Failli P,Ruocco C,et al.Fat-storing cells as liver-specific pericytes.Spatial dynamics of agonist-stimulated intracellular calcium transients [J].J Clin Invest,1992,90(2): 642.