胃癌患者術(shù)中腹腔沖洗液MMP-2mRNA、MMP-14 mRNA檢測(cè)的臨床意義

王一波,譚玉林,孫亞偉,湯黎明

(1.江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院 普外科,江蘇 常州,213017;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市二院 普外科,江蘇 常州,213002)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一，其死亡率居高不下，而腹腔轉(zhuǎn)移是胃癌最主要的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方式之一，統(tǒng)計(jì)表明在進(jìn)展期胃癌術(shù)后腹膜轉(zhuǎn)移占40%～50%[1]。因此對(duì)胃癌腹腔轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷，是提高胃癌治療效果的的重要途徑。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是由眾多相關(guān)因素共同參與的過程，目前文獻(xiàn)報(bào)道研究的相關(guān)因素有CK19mRNA、CK20 mRNA、COX-2mRNA、CEA mRNA等[2-3],而基質(zhì)金屬蛋白酶方面的研究少有報(bào)道，本文就采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)胃癌患者腹腔沖洗液MMP-2mRNA及MMP-14mRNA的表達(dá),來探討其在腹腔轉(zhuǎn)移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)本院倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)選擇臨床及病理資料完整的江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院普外科2008年1月—2009年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為胃癌患者98例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療，放療或生物治療,術(shù)前及術(shù)后病理學(xué)檢查均診斷為胃癌。其中男60例，女38例；年齡23～82歲,46例年齡≥60歲，52例<60歲，平均(61.3±12.5)歲；腫瘤的原發(fā)灶大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均由病理觀察確定，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移由病理學(xué)和臨床聯(lián)合確定。根據(jù)1990年世界衛(wèi)生組織(WHO)腫瘤分化程度判斷標(biāo)準(zhǔn)將胃癌患者分為高、中、低分化組,其中高分化組8例;中分化組50例,低分化組40例。胃癌分期采用2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn),其中Ⅰ/Ⅱ期患者36例,Ⅲ/Ⅳ期患者62例。Borrmann分型為Ⅰ/Ⅱ型者54例,Ⅲ/Ⅳ型者44例。腫瘤直徑≥5 cm者33例,<5 cm者65例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者71例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者巧27例。腫瘤浸潤(rùn)深度局限在漿膜層及漿膜內(nèi)者犯66例,累及漿膜層外者32例。腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移者28例,無轉(zhuǎn)移者70例。腹腔沖洗液陰性對(duì)照組為30例良性病變。胃癌免疫組織化學(xué)法對(duì)照組例數(shù)為20例，為良性胃病變黏膜組織。

標(biāo)本采集：所有胃癌病例均采集術(shù)前腹腔沖洗液,向腹腔內(nèi)注入無菌生理鹽水100 mL,收集后TRIZOL法提取腹腔沖洗液標(biāo)本中的總RNA,取少量RNA用于含量及純度測(cè)定,其余分裝后置-80 ℃保存待用。另收集30例良性病變病人腹腔沖洗液作為陰性對(duì)照。

1.2 材料與主要儀器

主要試劑: M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega M1705),SunShineBioTM總RNA提取試劑(SunShineBio SN114),GoTaq qPCR Master Mix(promega A6001),Oligo dT18(SunShineBio),Random prime (SunShineBio),RNase Inhibitor (SunShineBio R0004),dNTP (SunShineBio D0056)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

RT-PCR實(shí)驗(yàn)：從組織中提取總RNA。RT-PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作步驟：取滅過菌且無核酸酶的0.2 mL PCR管,依次加入無核酸酶的雙蒸水至總體積13.5 μL; 65 ℃保溫5 min,然后冰浴5 min; 0.2 mL PCR管依次加入下列組分至總體積20 μL; 先在37 ℃保溫1 h,然后70 ℃保溫15 min; SYBR Green RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟：為減少干擾，每個(gè)cDNA樣本都稀釋10倍(5 μL cDNA+45 μL H2O)引物mix(引物的F和R在同一管中)，濃度各為2 μm。一個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔；反應(yīng)體系：短暫離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)孔底部。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸31 s,共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析。按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行出來數(shù)據(jù)，閾值與Ct值由ABI Sequence Detection System軟件自動(dòng)得出。數(shù)據(jù)分析Real-time PCR輸出的結(jié)果是Ct值，樣本的MMP-2或MMP-14的Ct值-內(nèi)參GAPDH的Ct值為△Ct,MMP-2或MMP-14的表達(dá)量即為2-vCt×1000。

引物設(shè)計(jì)基因名稱引物序列片段長(zhǎng)度Beta-actinF,5′-CAGTCGGTTGGAGCGAGCAT-3′R,5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′115 bpMMP-2F,5′GCTGCAACCTGTTTGTGCTGA-3′R,5′-TCCGCATGGTCTCGATGGTA-3′105 bpMMP-14F,5′-CATTGGAGGAGACACCCACTTTG-3′R,5′-CCAGGAAGATGTCATTTCCATTCAG-3′83 bp

2 結(jié) 果

2.1 Real-timeRT-PCR檢測(cè)各目的基因在腹腔沖洗液中的表達(dá)

Real-timeRT-PCR檢測(cè)各指標(biāo)在腹腔沖洗液中的表達(dá)陽性率，見表1。

表1 MMP-2mRNA和MMP-14mRNA的表達(dá)

2.2 MMP-2mRNA表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理因素比較

通過統(tǒng)計(jì)分析可見，在胃癌腹腔液中MMP-2mRNA的表達(dá)陽性率隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的加深而顯著增加(P<0.01); MMP-2mRNA表達(dá)的陽性率還與腹腔內(nèi)是否轉(zhuǎn)移有關(guān),腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移的要明顯高于無腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移者(P<0.01); 并與胃癌的大體類型有關(guān),Borr3+Borr4型要明顯高于Borrl+Borr2型(P<0.01),見表2。

表2 MMP-2mRNA表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理因素比較[n(%)]

2.3 MMP-14mRNA表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理因素比較

通過統(tǒng)計(jì)分析可見,在胃癌腹腔液中MMP-14mRNA的表達(dá)陽性率隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的加深而顯著增加(P<0.01); MMP-14mRNA表達(dá)的陽性率還與腹腔內(nèi)是否轉(zhuǎn)移有關(guān),腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移的要明顯高于無腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移者(P<0.01); 并與胃癌的大體類型有關(guān),Borr3+Borr4型要明顯高于Borrl+Borr2型(P<0.01),見表3。

表3 MMP-14mRNA表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理因素比較[n(%)]

2.4 腹腔沖洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA之間表達(dá)的相關(guān)性

腹腔沖洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析,由表4可知MMP-2mRNA及MMP-14mRNA在胃癌患者腹腔沖洗液中的表達(dá)呈正相關(guān),(χ2=28.222,P=0.000,r=0.437)。

表4 腹腔沖洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

胃癌是中國(guó)人群中發(fā)病率和死亡率均占第一位的惡性腫瘤,腹腔轉(zhuǎn)移是胃癌無法手術(shù)根治的主要原因之一,也是術(shù)后復(fù)發(fā)治療失敗的主要原因[4]。腹腔內(nèi)脫落的癌細(xì)胞是形成腹腔轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，其關(guān)鍵步驟是腫瘤細(xì)胞穿越由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)組成的屏障是,Liu等[5]研究表明癌細(xì)胞可產(chǎn)生大量溶解酶降解基質(zhì)或基底膜，這些溶解酶與癌侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著相關(guān)，溶解酶系統(tǒng)由一龐大的蛋白溶解酶家族構(gòu)成,被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),它是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶,因需要Ca2+、zn2+等金屬離子作為輔助因子來發(fā)揮活性而得名[6],是一多基因家族，是人體內(nèi)降解ECM的主要酶類,是一類與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的生物酶,MMPs可以通過降解ECM、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞黏附能力、促進(jìn)新血管生成來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,從而參與腫瘤演進(jìn)等眾多生理和病理過程[7]。Real-time PCR是近年來使用的一種檢測(cè)技術(shù),因高精確度、高靈敏度、污染少等優(yōu)點(diǎn)已在生物醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科研及臨床醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。Kodera等[8]采用RT-PCR檢測(cè)195例胃癌患者的腹腔沖洗液CEA mRNA及CK20 mRNA,結(jié)果CEA mRNA陽性率為22%,CK20mRNA陽性率為23%,均高于腹腔灌洗細(xì)胞學(xué)檢查的陽性率(16%)。在各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法中,RT-PCR方法具有較高的靈敏度，從而使得胃癌腹腔微轉(zhuǎn)移檢測(cè)成為可能，在98例胃癌腹腔沖洗液中檢測(cè)各目的基因的表達(dá)，定量范圍寬廣直觀,是檢測(cè)基因表達(dá)最理想的方法。本實(shí)驗(yàn)中,通過擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析，可見窄而尖的熔點(diǎn)峰，表明實(shí)驗(yàn)中無污染，引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物純度高,可見該反應(yīng)體系完好,PCR擴(kuò)增特異性高,可信度高，可用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

目前尚無公認(rèn)的胃癌特異性腫瘤標(biāo)志物或基因，這極大地降低了腹膜微轉(zhuǎn)移檢查的臨床價(jià)值。所以目前尋找靈敏性與特異性更好的分子標(biāo)志物，能夠有效地提高腹腔內(nèi)脫落腫瘤細(xì)胞的檢出率成為關(guān)鍵的任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)在MMPs中選取具有代表性的與胃癌臨床病理關(guān)系密切相關(guān)的2種標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14),研究它們?cè)谖赴└骨晦D(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。MMP-2基因位于染色體16q21,由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子所組成，結(jié)構(gòu)基因總長(zhǎng)度為27 kb,MMP-2基因編碼分子量約72 kd的酶原，經(jīng)活化后水解為65 kd的活性形式。MMP-2是一種Ⅳ型膠原酶和明膠酶，可以降解細(xì)胞基質(zhì)以及Ⅳ型膠原，形成局部溶解區(qū)以構(gòu)成腫瘤細(xì)胞移動(dòng)的通道[9]。其生理功能主要是參與傷口愈合,生殖以及生殖器官的復(fù)舊等。正常成人組織中它的水平較低，只有在系統(tǒng)接受一個(gè)刺激或病理狀態(tài)下其水平才會(huì)升高[10]。

MMP-14屬于膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，膜型MMP分子均有前肽PRCGVPD高度保守序列、Zn2+結(jié)合位點(diǎn)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)及3個(gè)獨(dú)特的插入序列。多數(shù)膜型MMP既是MMP的受體,也是MMP的激活劑,而且可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白。以往研究發(fā)現(xiàn),在一些其他組織中,MMP-14是通過形成MMP-14/TIMP-2/pro-MMP-2三重復(fù)合物來激活MMP-2。

在本研究中，作者采用RT-PCR方法,對(duì)98例胃癌患者的腹腔沖洗液進(jìn)行上述標(biāo)志物mRNA表達(dá)的并行檢測(cè),并取30例良性病變腹腔沖洗液作為陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,98例胃癌腹腔沖洗液中,MMP-2mRNA陽性率為42.9%(42/98),MMP-14mRNA陽性率為40.8%(40/98),而陰性對(duì)照組分別為1/30(3.33%)、2/30(6.67%)、0/30(0%)、1/30(3.33%),胃癌組遠(yuǎn)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),顯示了良好的敏感性。

通過統(tǒng)計(jì)分析可見,在胃癌腹腔液中MMP-2、MMP-14的表達(dá)陽性率與胃癌生長(zhǎng)方式有關(guān)，隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的加深而顯著增加(P<0.01),亦隨著漿膜類型的惡變而顯著增加(P<0.05); 兩種基因的mRNA表達(dá)的陽性率還與腹腔內(nèi)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，腹膜轉(zhuǎn)移的要明顯高于無腹膜轉(zhuǎn)移者(P<0.01); 并與胃癌的大體類型有關(guān),Borr3+Borr4型要明顯高于Borrl+Borr2型(P<0.01)。本研究還進(jìn)一步分析了胃癌腹腔液中MMP-2、MMP-14的表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的關(guān)系。這2種標(biāo)志物的表達(dá)隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的增加而顯著增加，亦隨著漿膜類型的惡變而顯著性增加，說明這2種標(biāo)志物與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過程是密切相關(guān)的，提示該方法適用于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)和亞臨床轉(zhuǎn)移的篩檢。

本實(shí)驗(yàn)通過統(tǒng)計(jì)分析腹腔沖洗液中MMP-2和MMP-14之間表達(dá)的相關(guān)性,98例胃癌腹腔沖洗液中MMP-2和MMP-14表達(dá)正相關(guān)性(r=0.473,P<0.01); 說明MMP-2與MMP-14在胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中,具有正協(xié)同作用。

因此通過Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)胃癌患者腹腔沖洗液中目的基因mRNA來預(yù)測(cè)腹腔中的腫瘤細(xì)胞是可靠的,具有較高的敏感性和特異性，可及早發(fā)現(xiàn)常規(guī)檢查所不能及的微轉(zhuǎn)移灶。

[1]Yonemura Y,Bandou E,Sawa T,et al.Neoadjuvant treatment of gastric cancer with peritoneal dissemination[J].Eur J Surg Oncol,2006,32(6): 661.

[2]許德國(guó),王濰博.胃癌患者腹腔灌洗液CK19 mRNA、CEAmRNA的檢測(cè)及其臨床意義[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2008,46(20): 600.

[3]韓少良,姚建高,張陪趁,等.胃癌術(shù)中腹腔沖洗液Cox-2 mRNA及CEA mRNA檢測(cè)臨床意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(8): 607.

[4]Koder Y,Yamamura Y,ToriiA,et al.Post-operative staging of gastric cancer: A comparioson between the UICC stage classification and the 12th edition of theGeneral Rules for gastric study[J].Seand J Gastrioentrol,1996,31(5): 476.

[5]Liu H Q,Song S,Wang J H,et al.Expression of MMP-3 and TIMP-3 in gastric cancer tissue and its clinical significance[J].Oncol Lett,2011,2(6): 1319.

[6]Vermar P,HansehC.Matrixmetalloproteinases(MMPs):chemical-biological functions and(Q)SARs[J].Bioorg Med Chem,2007,15(6): 2223.

[7]Hwang T L,Lee L Y,Wang C C,et al.Claudin-4 expression is associated with tumor invasion,MMP-2 and MMP-9 expression in gastric cancer[J].Exp Ther Med,2010,1(5): 789.

[8]Kodera Y,Nakanishi H,Ito S,et al.Prognostic significance of intraperitoneal cancer cells in gastric carcinoma:detection of cytokeratin 20 mRNA in peritoneal washes,in addition to detection of carcinoembryonic antigen[J].Gastric Cancer,2005,8(3): 142.

[9]Noh S,Jung J J,Jung M,et al.MMP-2 as a putative biomarker for carcinomatosis in gastric cancer[J].Hepatogastroenterology,2011,58(112): 2015.

[10]Mrena J,Wiksten JP,Nordling S,et al.MMP-2 but not MMP-9 associated with COX-2 and survival in gastric cancer[J].J Clin Pathol,2006,59(6): 618.