豫醫卷毛大鼠轉化生長因子α基因的比較生物學分析*

張明昊，章金濤

1)河南中醫學院基礎醫學院醫學機能實驗室 鄭州 450046 2)鄭州大學實驗動物中心 鄭州 450052

豫醫卷毛大鼠轉化生長因子α基因的比較生物學分析*

張明昊1)△，章金濤2)

1)河南中醫學院基礎醫學院醫學機能實驗室 鄭州 450046 2)鄭州大學實驗動物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實驗師，研究方向：動物遺傳學，E-mail:zhangminghao@139.com

卷毛大鼠；轉化生長因子α；同源性比較

目的：對豫醫卷毛大鼠的轉化生長因子α(TGFα)基因進行比較生物學分析。方法采用PCR方法對豫醫卷毛大鼠TGFα的cDNA序列進行克隆、測序，并與BN大鼠、小家鼠、黃牛、野豬、獼猴、黑猩猩、人、原雞、鵪鶉和斑馬魚的TGFα cDNA序列及其編碼產物的氨基酸序列進行同源性比較和系統遺傳學分析。結果獲得了豫醫卷毛大鼠TGFα基因全長970 bp的cDNA序列(GenBank登錄號：KF366251)。豫醫卷毛大鼠與BN大鼠、小家鼠、黃牛、野豬、獼猴、黑猩猩、人、原雞、鵪鶉和斑馬魚的同源性分別為98.6%、95.0%、85.5%、85.3%、85.5%、86.3%、86.3%、73.2%、73.2%和56.8%，氨基酸序列的同源性分別為98.8%、96.9%、90.6%、90.6%、91.2%、91.9%、91.9%、72.6%、72.6%和38.8%。結論TGFα基因在進化過程中具有較高的保守性，但不同物種之間也具有功能上的特異性。

轉化生長因子α(transforming growth factor α, TGFα)是表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)家族的主要成員之一，最初被發現于逆轉錄病毒轉化的成纖維細胞的培養基中，因其可誘導大鼠腎成纖維細胞增生而得名[1]。TGFα和EGF具有相同的受體EGFR，通過與之結合可使正常細胞有絲分裂活躍，促進細胞增殖，并在胚胎發育、創傷修復、腫瘤及毛囊和眼的發生等過程中起重要作用[2-4]。卷毛突變是一種較為少見的基因突變，該種突變動物的被毛和胡須均發生彎曲。國外已報道了幾種類型，如wave-1、wave-2、cub、swh等[5-7]，國內少有報道。作者曾于2006年在SD大鼠繁殖種群中發現了1只被毛卷曲的雌性大鼠，經遺傳測交實驗證實該卷毛性狀受常染色體上單一顯性基因控制，呈現半顯性遺傳，現已被命名為豫醫卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat, YCHR)[8-10]。有報道[11]指出，小鼠胚胎缺乏TGFα就會產生波紋狀鼠，這種鼠的眼部發育畸形，胡須和毛發呈現明顯的波紋狀，而導致此性狀出現的致波紋基因就是TGFα基因的等位基因。由此可見，TGFα是毛發生長發育過程中的重要基因之一，對其進行深入研究將有助于了解該基因在生物體生長發育過程中的作用，并且揭示毛發卷曲及波紋狀性狀產生的機制。為了深入研究YCHR和其他物種TGFα基因cDNA序列的同源性，作者克隆了YCHR TGFα基因的cDNA序列，并與GenBank上發布的其他物種的TGFα基因cDNA序列進行了同源性比較，旨在進一步探討TGFα基因的同源性及其比較生物學特征。

1 材料與方法

1.1實驗動物8周齡YCHR 10只，雌雄各半，由鄭州大學實驗動物中心提供，一級環境條件下飼養。

1.2TGFα基因cDNA序列的擴增與測序DNA的提取及處理：處死大鼠后立即取腦組織，用液氮速凍后貯存于-196 ℃液氮罐中，用DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)提取總DNA，保存于-80 ℃冰箱中待用。

引物設計及合成：根據GenBank上發布的大鼠TGFα基因cDNA序列(GenBank登錄號：NM012671)，采用DNAStar軟件包的PrimerSelect程序設計了5對重疊引物(表1)，用以擴增SD大鼠TGFα基因的cDNA序列。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

兩輪擴增測序：取適量的DNA進行PCR擴增。第1輪反應液組成：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，dH2O 35.5 μL，總體系為50 μL。第1輪反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～50 s，25個循環；最后72 ℃修復延伸5 min，4 ℃保存。第2輪反應液組成：PCR產物0.2 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，dH2O 36.3 μL，總體系為50 μL。第2輪反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30～50 s，35個循環；最后72 ℃修復延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產物在10 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，將有目的條帶的PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司雙向測序。

表1 擴增TGFα基因cDNA所用引物

1.3TGFα基因cDNA序列和氨基酸序列分析將獲得的序列在GenBank上進行Blast初步比較分析，根據序列重疊區域拼接YCHR TGFα基因cDNA的完整序列，并下載BN大鼠(NM012671)、小家鼠(NM031199)、黃牛(XM002691233)、野豬(NM214251)、獼猴(XM002799271)、黑猩猩(XM001142892)、人(NM003236)、原雞(NM001001614)、鵪鶉(AB258390)和斑馬魚(NM001144052)的TGFα基因序列，采用DNAMAN和DNASTAR軟件進行同源性比較和系統遺傳學分析。

2 結果

2.1YCHRTGFα基因cDNA的克隆PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到特異性的目的條帶，產物大小與預期結果一致(圖1)。測序結果在NCBI上經Blast比較分析，確認結果為TGFα基因序列。序列拼接顯示YCHR TGFα基因的完整cDNA序列長970 bp。

2.2TGFα基因的比較生物學分析結果見表2、3，系統遺傳分析結果見圖2。TGFα基因的系統進化樹顯示，YCHR與BN大鼠處于一支，和小家鼠的親緣關系較近，人和黑猩猩、黃牛和野豬、原雞和鵪鶉以及斑馬魚分別處于另外的分支。

1：TGFα-1擴增產物；2：TGFα-2擴增產物；3：TGFα-3擴增產物；4：TGFα-4擴增產物；5：TGFα-5擴增產物。

1：YCHR；2：BN大鼠(NM012671)；3：小家鼠(NM031199)；4：黃牛(XM002691233)；5：野豬(NM214251)；6：獼猴(XM002799271)；7：黑猩猩(XM001142892)；8：人(NM003236)；9：原雞(NM001001614)；10：鵪鶉(AB258390)；11：斑馬魚(NM001144052)。

表3 YCHR與其他物種TGFα氨基酸序列的同源性比較 %

1：YCHR；2：BN大鼠(NP036803)；3：小家鼠(NP112476)；4：黃牛(XP002691279)；5：野豬(NP999416)；6：獼猴(XP002799317)；7：黑猩猩(XP001142892)；8:人(NP003227)；9:原雞(NP001001614)；10:鵪鶉(BAF49419)；11:斑馬魚(NP001137524)。

圖2 TGFα基因的系統進化樹

3 討論

TGFα作為推動細胞周期的因子，廣泛分布于癌細胞、轉化細胞和胚胎組織中，其與EGFR結合后，會導致受體相關的酪氨酸激酶活化，引發促進細胞分裂，與腫瘤的發生、發展密切相關[12]。TGFα基因也是一個重要的多效基因，它的突變可導致機體生長發育異常。為了深入了解TGFα基因組成的差異，作者克隆了TGFα基因cDNA序列(GenBank登錄號：KF366251)，共計長970 bp，其中蛋白編碼序列長度為483 bp。該基因編碼的蛋白質由160個氨基酸殘基組成。在此基礎上，作者對包括YCHR在內的10個物種的11條TGFα基因的cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列的同源性進行了分析，發現YCHR TGFα基因同GenBank上發布的BN大鼠、小家鼠、黃牛、野豬、獼猴、黑猩猩、人、原雞、鵪鶉和斑馬魚的同源性分別為98.6%、95.0%、85.5%、85.3%、85.5%、86.3%、86.3%、73.2%、73.2%、56.8%，氨基酸序列的同源性分別為98.8%、96.9%、90.6%、90.6%、91.2%、91.9%、91.9%、72.6%、72.6%、38.8%，表明該基因在哺乳動物中具有較高的保守性，其編碼蛋白可能具有相同的結構域，僅在哺乳類、鳥類和魚類之間存在一定的功能上的差異。進一步分析 TGFα基因及編碼蛋白，發現該基因在人類與各種模式生物之間存在著一定的序列與功能上的異同點，利用這一特點，可把來源于其他模式生物的 TGFα基因作為人類TGFα基因的天然突變體來進一步研究其結構和功能。

綜上所述，作者克隆并獲得了YCHR TGFα基因cDNA的完整序列，已提交給GenBank，并通過對不同物種TGFα基因及氨基酸序列的同源性比較，初步了解了 TGFα基因在物種進化上的保守性與特異性，為下一步進行 TGFα基因的多態性檢測以及其與毛發生長和YCHR某些性狀的相關性研究積累了基礎資料。

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(2014-02-27收稿 責任編輯徐春燕)

Comparative biology analysis of TGFα gene from Yuyi curly hair rats

ZHANGMinghao1),ZHANGJintao2)

1)MedicalScienceFunctionLaboratory,SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046 2)LaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

curly hair rat; transforming growth factor α; homology comparison

Aim: To study the difference of transforming growth factor alpha(TGFα) gene between Yuyi curly hair rats and other species. Methods: PCR technique was developed to clone the sequence of cDNA of TGFα gene from Yuyi curly hair rats, and biologic characters of nucleotide and amino acid sequence encoding TGFα gene in different species (rattus norvegicus, mus musculus,bos taurus, sus scrofa, macaca mulatta, pan troglodytes, homo sapiens, gallus gallus,coturnix japonica, and danio rerio) were analyzed. Results: A full-length cDNA of Yuyi curly hair rats was 970 bp (Accession Number: KF366251). The TGFα gene nucleotide homology of Yuyi curly hair rats to rattus norvegicus, mus musculus,bos taurus, sus scrofa, macaca mulatta, pan troglodytes, homo sapiens, gallus gallus,coturnix japonica and danio rerio was 98.6%, 95.0%, 85.5%, 85.3%, 85.5%, 86.3%, 86.3%, 73.2%, 73.2% and 56.8%, and that of amino acid sequences was 98.8%, 96.9%, 90.6%, 90.6%, 91.2%, 91.9%, 91.9%, 72.6%, 72.6% and 38.8%, respectively. Conclusion: A high degree of conservation of TGFα gene exists among different mammalian taxons,but there are some specificities among different species.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.002

*國家自然科學基金資助項目 31071923

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