肺癌荷瘤小鼠體內組織中2－甲氧基雌二醇納米混懸劑的分布*

賈 欣，韓淑萍，孫惠斌，王宇輝，張超鋒，杜 斌

1)鄭州大學藥學院 鄭州450001 2)鄭州市第二人民醫院藥劑科 鄭州450006

2－甲氧基雌二醇(2－ME)是一種新型甾體激素類抗腫瘤藥物，目前在國外處于Ⅱ期臨床研究階段［1－2］。體內外藥效學研究［3－5］表明，2－ME 對多種腫瘤細胞均有良好的抗腫瘤作用，且具有高效低毒、不易產生耐藥性等特點。然而2－ME 水溶性差，口服吸收無規律，明顯的首過效應［6］限制了其應用。針對這些缺點設計了供靜脈注射用的2－ME 納米混懸劑［7］。該研究中作者建立了Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，進一步研究2－ME 納米混懸劑在肺癌荷瘤鼠體內組織的分布，以期為該劑型的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料 藥品與試劑:2－ME(純度99%，自制)，環孢素A(純度98．5%，批號120308，武漢鑫佳靈生物科技有限公司)，胎牛血清(批號1010511，美國TCB 公司)，甲醇(色譜純，德國Merck 公司)，乙腈(分析純，天津市協和昊鵬色譜科技有限公司)，其他試劑均為分析純。實驗動物:SPF 級昆明種小鼠雌雄各半，(20 ±2)g，由山東魯抗醫藥股份有限公司提供，動物質量合格證號SCXK(魯)20080002。瘤株:鼠源性肺腺癌細胞株Lewis 購自上海生命科學研究院細胞資源中心。儀器:Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)，T25 數顯勻漿機(德國IKA 實驗技術公司)，MD200－2 型氮氣吹掃儀(杭州奧盛儀器有限公司)，Z36HK 大容量高速冷凍離心機(德國貝托特·哈默機械制造股份公司)。

1．2 試液的配制

1．2．1 2－ME 貯備液及標準溶液的制備 精密稱取2－ME 64．00 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，配制成2．56 g/L 的2－ME 貯備液。以上述貯備液配制成質量濃度范圍在0．25～256．00 mg/L的標準溶液。

1．2．2 2－ME 溶液的配制 精密稱取2－ME 40．00 mg 溶于2 mL 無水乙醇中，加超純水7 mL、聚氧乙烯氫化蓖麻油1 mL，50℃熱熔攪拌0．5 h，制成質量濃度為4．00 g/L 的2－ME 溶液［8］，滅菌。

1．2．3 2－ME 納米混懸劑的制備 精密稱取2－ME 32．00 mg 和卵磷脂192．00 mg，加入無水乙醇4 mL，超聲使溶解，構成有機相;稱取192．00 mg 泊洛沙姆188、3．20 mg 十二烷基硫酸鈉及19．20 mg 羧甲基纖維素鈉，溶于8 mL PBS 中，構成水相。3 000 g 磁力攪拌下將有機相緩慢滴入水相，繼續攪拌30 min，充分乳化，然后常溫減壓旋蒸除去有機溶劑，探超30次，每次3 s，制得4．00 g/L 乳白色納米混懸劑。

1．3 實驗動物分組與處理 參照文獻［9］建立Lewis 肺癌荷瘤鼠模型并將荷瘤鼠采用隨機數字表法分為2組，即2－ME 納米混懸劑組(實驗組)和2－ME溶液組(對照組)，每組35只。給藥前禁食12 h，自由飲水。實驗組小鼠尾靜脈注射40 mg/kg 的2－ME 納米混懸劑，對照組同法給予2－ME 溶液。給藥5、15、30、60、120、240、480 min 后分別取5只小鼠，摘眼球取血，脫頸椎處死后，立即分離心、肝、脾、肺、腎、胃、腦及瘤組織樣品，－20℃冰箱保存。精密稱取各組織樣品，加入生理鹽水(樣品質量與生理鹽水體積比，肝、腎、胃、腦、瘤按1∶2，脾、心按1∶3，肺按1∶4)，用組織勻漿機研磨處理，制成組織勻漿液。取組織勻漿液(腎、肺、肝、腦、脾及瘤組織取500 μL，血漿、心及胃組織取250 μL)于5 mL玻璃離心管中，加入6 倍體積的乙酸乙酯－乙腈－異丙醇(體積比為3∶2∶1)，渦流混合3 min，超聲10 min，4 000 g 離心15 min，取上清液，40℃下氮氣流吹干，殘留物加100 μL 流動相復溶，渦流振蕩1 min，15 000 g 離心15 min，取上清液20 μL 進樣。

1．4 色譜條件 Diamosil－C18(200 mm×4．6 mm，5 μm)為分析柱;流動相為甲醇∶水(體積比為65∶35);流速1 mL/min;柱溫30℃;激發波長285 nm，發射波長325 nm;20 μL 進樣。

1．5 方法學驗證 標準曲線和定量限:精密量取不同質量濃度的2－ME 標準溶液，40℃氮氣吹去溶媒，分別加入空白血漿及組織的空白勻漿樣品，渦旋1 min 混勻，配制成不同質量濃度的標準溶液(n =3)，以峰面積A 對樣品中藥物濃度C 進行回歸，得回歸方程，取S/N≥10 時樣品濃度作為最低定量限。

日內精密度、日間精密度、提取回收率及方法回收率:取空白血漿和組織勻漿液，加入2－ME 溶液，配制成低、中、高3個濃度的質控樣品，按1．3 處理生物樣品，分別于日內測定5次計算日內精密度;連續測定5 d 計算日間精密度，并計算方法回收率及提取回收率。

1．6 數據處理和靶向性評價 采用Kinetica 4．4．1藥動學軟件(賽默飛世爾科技公司開發)對每個時間點血漿及各組織2－ME 的平均濃度進行分析，得AUC0－t。給藥系統的靶向性評價采用相對攝取率(re)及總靶向效率(TEC)為評價參數，TEC =AUCi/∑AUC ×100%，AUCi 表示i組織的藥時曲線下面積，TEC 越大，對該組織的靶向性越顯著。re =(AUCi)實驗組/(AUCi)對照組×100%，表示在某一組織或樣本2種不同制劑的藥物分布情況。

2 結果

2．1 方法學考察結果

2．1．1 色譜行為 血漿及各組織中內源性物質對樣品測定無干擾，樣品的保留時間為(10．28 ±0．73)min，分離度較好(圖1)，理論塔板數均大于4 000。

2．1．2 線性范圍 結果見表1。

2．1．3 精密度與回收率 結果見表2。

2．2 組織分布結果 不同時間點2－ME 納米混懸液和2－ME 溶液在血漿和組織中的分布情況見表3。由表3 可知，對照組(2－ME 溶液組)中藥物主要分布在血液以及血流豐富的組織中，血漿中分布最多，其次為肺、肝、腎;而實驗組(2－ME 納米混懸劑組)藥物在血漿中的分布明顯減少，在肺、瘤及肝組織中的分布明顯增加，說明2－ME 納米混懸劑具有明顯的被動靶向性。

圖1 血漿和組織色譜圖

表1 2-ME 在各生物樣品中的標準曲線

2．3 靶向性評價 2－ME 納米混懸劑和2－ME 溶液的TEC 和re 結果見表4。由表4 可知，2－ME 納米混懸劑在肺、瘤組織中的總靶向效率明顯提高，肝組織中的靶向效率略有提高，在其他組織中的靶向分布均有所減低，其中在血漿中的分布減低尤為顯著。心、肝、脾、肺、腦、瘤組織的re 均大于1，瘤組織的re最大。

表2 2-ME 在各生物樣品中的精密度及回收率(n=5)

表3 不同時間點2-ME 納米混懸劑和2-ME 溶液在血漿和組織中的分布情況(n=5) μg/g

表4 2-ME 納米混懸劑和2-ME溶液在血漿和組織中的TEC 和re

3 討論

研究［10］表明，2－ME 與血漿蛋白的結合率較高。在2－ME 溶液中，藥物成游離的分子狀態，使得藥物可迅速與血漿蛋白結合，結合型藥物不能透過毛細血管向組織器官轉運，藥物大量滯留于血液中。而2－ME 納米混懸劑呈亞微米膠態分散體系，在血漿中常會被巨噬細胞作為外來物而吞噬，巨噬細胞主要分布于肺、疏松結締組織、肝、脾等處［11］，因而降低了藥物在血液中的濃度，更多地到達靶部位。有關2－ME 與肺細胞膜親和性的研究［12］結果表明，肺泡表面存在與2－ME 特異性結合的受體，使得2－ME 納米混懸劑具有較好的肺靶向性。腫瘤組織生長快速，血管形成較快，導致血管外膜細胞缺乏、基底膜變形，通透性增加，納米粒有更多的機會蓄積在瘤體部位［13］，因此具有較好的腫瘤靶向性。該研究結果顯示，2－ME 納米混懸劑在血漿中的分布明顯減少，在肺、瘤及肝組織中分布明顯增加，說明2－ME 納米混懸劑具有明顯的被動靶向性。此外，靶向性評價結果顯示，心、肝、脾、肺、腦、瘤組織的re 均大于1，瘤組織的re 最大，說明2－ME 納米混懸劑對心、肝、脾、肺、腦、瘤均具有靶向性，且對瘤組織的靶向性最好。

總之，2－ME 納米混懸劑具有良好的肺腫瘤靶向性，使用2－ME 納米混懸劑有望增強藥物的治療效果，提高治療指數;該研究為肺腫瘤的靶向治療提供了一定的實驗依據。

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