河南漢族腦梗死患者血漿HCY水平及MS A2756G基因多態性檢測*

李艾帆，張 華，范玉佳，燕 燕，李彥玲，趙幸娟，鄭 紅，許予明

1)鄭州市第一人民醫院神經內科 鄭州450004 2)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州450001 3)鄭州市婦幼保健院 鄭州450053 4)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州450052

腦血管病具有高發病率、高復發率、高病死率及高致殘率的特點，是全球范圍內威脅中老年人健康的主要疾病之一，其中80%為缺血性卒中［1］。動脈粥樣硬化是缺血性卒中一個重要的可控制的危險因素，除了傳統的危險因素，如高血壓、糖尿病、心臟病、高脂血癥外，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥是近年來發現的新的卒中危險因素。許多研究［2-4］認為，高Hcy 血癥和高脂血癥在動脈粥樣硬化的發生中起重要的作用。蛋氨酸合成酶(methionine synthase，MS)是Hcy 代謝途徑中的關鍵酶之一，MS 基因2756A→G 突變(MS A2756G)在西方人群中比較常見，可導致血漿Hcy 水平的改變［5］，但國內的研究［6-7］存在爭議。作者檢測300例河南漢族腦梗死患者血漿Hcy 水平及MS A2756G 基因多態性，旨在進一步探討血漿Hcy 水平及MS A2756G 基因多態性與河南漢族人群腦梗死的關系。

1 對象與方法

1．1 研究對象 選取2012年12月至2013年9月在鄭州市第一人民醫院神經內科住院的腦梗死患者300例，診斷標準參照WHO 修訂的各類腦血管疾病診斷要點。大動脈粥樣硬化性腦梗死96例，小動脈閉塞性腦梗死191例，心源性腦梗死5例，其他原因所致腦梗死3例，不明原因所致腦梗死5例。患者中男148例，女152例，年齡22～83(64．2 ±13．2)歲。對照組選擇同期門診健康體檢者261例，其中男127例，女134例，年齡21～79(63．8 ±13．7)歲，均為無血緣關系的河南漢族人群，無腦卒中病史及家族史。以上兩組均排除患癲癇、癌癥、甲狀腺功能異常、肝腎功能不全及胃部疾病伴巨幼紅細胞貧血者。

1．2 血漿Hcy 水平測定 抽取空腹靜脈血2 mL，采用循環酶法檢測血漿Hcy 水平，＞15 mol/L 為高Hcy 血癥。

1．3 PCR-RFLP 檢測MS A2756G 基因多態性

1．3．1 基因組DNA 提取和引物設計 采集外周靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，采用酚-氯仿法提取人基因組DNA，無水乙醇沉淀后，加60 mL ddH2O 溶解。引物設計參照文獻［3］。上游引物序列:5'-CATG GAAGAATATGAAGATATTAGAC-3';下游引物序列:5'-GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA-3'，PCR 擴 增產物大小為189 bp。

1．3．2 MS 基因特定片段的PCR 擴增 PCR 反應體系25 μL:STR Buffer(包含MgCl2、Dntp、10 ×Buffer)2．5 μL，上、下游引物各2．0 μL，Taq 酶0．4 μL，模板DNA 1．5 μL，ddH2O 補至25 μL。PCR 擴增條件:92℃預變性2 min;92℃60 min，56℃60 min，72℃90 min，35個循環;72℃延伸7 min。PCR 產物經20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色。

1．3．3 限制性內切酶酶切PCR 擴增產物 酶切反應體系20 μL，包括PCR 擴增產物10 μL，Hae Ⅲ0．5 μL，Buffer R 2．0 μL，ddH2O 7．5 μL。酶切產物在37℃水浴鍋中溫浴16 h。取6 μL 擴增產物加入20 g/L 瓊脂糖凝膠負極端的加樣孔，以溴酚藍為指示劑，EB 為染色劑，在10 V 電壓下電泳30 min，凝膠成像儀下觀察并照相。

1．3．4 測序與鑒定 選取各基因型位點野生型、雜合突變型各30例、純合突變型3例的PCR 產物，由上海寶生物有限公司進行測序分析。

1．4 統計學處理 采用SPSS 17．0 分析。兩組年齡的比較采用兩獨立樣本t 檢驗，性別和各疾病發病率以及MS A2756G 基因型和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗。不同基因型和不同腦梗死類型間血漿Hcy 水平的比較采用單因素方差分析。定量資料相關性采用線性相關分析，有等級資料的相關關系采用等級相關分析。血漿Hcy 水平、MS A2756G 基因型及其他危險因素與腦梗死的相關關系用logistic 回歸分析，結果以相對危險度(odds ratio，OR)和95%可信區間(95%CI)表示。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 兩組一般資料比較 腦梗死組高血壓及糖尿病的發病率均高于對照組，結果見表1。

表1 兩組一般資料比較

2．2 兩組及不同腦梗死類型血漿Hcy 水平比較腦梗死組血漿Hcy 水平為(19．3 ±7．2)μmol/L，高于對照組的(15．1±4．9)μmol/L(t =8．031，P＜0．001)。不同腦梗死類型患者血漿Hcy 水平比較見表2。

表2 不同腦梗死類型患者血漿Hcy 水平比較 μmol/L

2．3 PCR-RFLP 結果

2．3．1 酶切產物的判定結果 PCR 擴增產物經酶切后有3種基因型:野生型(AA 型)只有189 bp 片段;雜合突變型(AG 型)有159 和189 bp 片段;純合突變型(GG 型)只有159 bp 片段。電泳結果見圖1。

圖1 酶切產物電泳結果

2．3．2 PCR 產物測序結果 見圖2。

圖2 PCR 產物測序結果

2．4 兩組MS A2756G 基因型及等位基因頻率分布比較 兩組人群基因型分布均符合Hardy-weinberg 平衡(χ2=1．897，P=0．169)，具有人群代表性。腦梗死組和對照組間3種基因型和2種等位基因頻率分布的比較見表3。

表3 兩組MS A2756G 基因型和等位基因頻率分布比較例(%)

2．5 MS A2756G 基因型與血漿Hcy 水平的關系474例MS A2756G AA 型、84例AG 型和3例GG 型受檢者血漿Hcy水平分別為(17．31 ± 6．71)、(17．42 ±5．73)、(19．03 ±6．50)μmol/L，3 者比較差異無統計學意義(F=0．110，P=0．896)。

2．6 腦梗死危險因素分析 相關分析顯示，血漿Hcy 水平與腦梗死的發生相關(r = 0．390，P＜0．001)，MS A2756G 基因多態性與血漿Hcy 水平無關(r =0．036，P =0．391)，與腦梗死的發生無關(r= －0．003，P =0．943)。以MS A2756G 多態性、Hcy 水平、高血壓、糖尿病、高脂血癥為自變量(MS A2756G 基因野生型為0，突變型為1;無高Hcy 血癥為0，高Hcy 血癥為1;無糖尿病為0，糖尿病為1;無高血壓為0，高血壓為1;無高脂血癥為0，高脂血癥為1)，以腦梗死是否發生作為因變量，采用logistic回歸模型進行多因素分析，結果顯示高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy 血癥可以增加腦梗死的發病風險，MS A2756G 基因突變不增加腦梗死的風險。結果見表4。

表4 腦梗死危險因素的logistic 回歸分析結果

3 討論

Hcy 是一種含硫氨基酸，是機體內蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的一個重要中間產物。Hcy 在MS 催化下，以維生素B12 為輔酶，通過甲基化合成甲硫氨酸，通過再甲基化形成蛋氨酸。在Hcy 代謝過程中，甲硫氨酸合成酶的遺傳缺陷以及葉酸、維生素B12 的缺乏均可使體內的甲硫氨酸代謝發生障礙，導致血漿Hcy 水平升高。近年來一些研究［2］已經證明血漿Hcy 水平升高與動脈粥樣硬化性血管疾病，包括缺血性卒中有關。研究［8］認為高Hcy 血癥與小動脈閉塞性卒中關系更密切;也有一些研究［9-10］認為高Hcy 血癥與大動脈粥樣硬化性卒中相關。這些研究結論仍有爭議。該研究結果顯示，腦梗死組的血漿Hcy 水平高于對照組，與Masser等［11］的研究結果一致。相關分析結果顯示，血漿Hcy 水平與腦梗死的發生相關。Logistic 回歸分析結果顯示高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy 血癥可以增加腦梗死的發病風險。以上結果提示在河南漢族人群中，高Hcy 血癥是腦梗死的獨立危險因素。

1996年Leclerc 等［5］首次在葉酸/維生素B12代謝障礙的cbⅠG 互補組患者中發現，甘氨酸取代了位于第919 位上的天冬氨酸;G 等位基因在加拿大白人中的分布較高，該位點突變影響了甲硫氨酸的甲基化過程，使體內的Hcy 水平降低，可以降低心血管事件的發生率。張廣森等［12］研究發現，Hcy代謝相關酶G 等位基因頻率在心腦血管組與正常對照組之間的差異無統計學意義。該研究結果顯示，河南漢族人群中MS A2756G 基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義。

MS A2756G 多態位點AA、AG、GG 3種基因型受檢者的血漿Hcy 水平差異無統計學意義，提示MS A2756G 基因突變對血漿Hcy 水平無明顯影響，與國內外文獻［13-15］報道一致。Logistic 回歸分析結果顯示，MS A2756G 基因突變不是腦梗死的獨立危險因素。由于MS A2756G 位點的突變率相對較低，要充分展示MS A2756G 位點多態性與腦梗死的關系，需要進一步擴大樣本量，還需進行腦梗死的多個候選基因的聯合分析。

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