霉酚酸酯對糖尿病腎病大鼠腎組織TLR4、IL-18表達的影響

申鵬霄，王建生，趙瑛瑛

鄭州大學第二附屬醫院腎內科 鄭州 450014

霉酚酸酯對糖尿病腎病大鼠腎組織TLR4、IL-18表達的影響

申鵬霄，王建生#，趙瑛瑛

鄭州大學第二附屬醫院腎內科 鄭州 450014

#通訊作者，女，1957 年 11 月生，碩士，教授，研究方向:腎小球疾病，E-mail:wjs9857@sina.com

糖尿病腎病；霉酚酸酯；TLR4；IL-18；大鼠

目的：探討霉酚酸酯對糖尿病腎病大鼠腎臟Toll樣受體-4(TLR4)及白細胞介素-18(IL-18)表達的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為對照組(n=12)、模型組(n=11)、治療組(n=11)，后2組制作糖尿病腎病模型。治療組每天給予霉酚酸酯15 mg/kg灌胃，余2組給予溶媒灌胃。于12周末采用HE染色、PAS染色觀察腎臟病理改變，免疫組化、Western blot檢測腎組織TLR4、IL-18蛋白的表達。結果與對照組比較，模型組大鼠腎小球體積增大，基底膜增厚，炎癥細胞浸潤明顯，而治療組較模型組有所改善。3 組大鼠腎組織TLR4、IL-18蛋白的表達差異有統計學意義，其中模型組大鼠腎組織TLR4、IL-18蛋白的表達均高于對照組(P<0.05)，治療組上述2指標較模型組下降(P<0.05)。結論霉酚酸酯可能通過下調腎臟TLR4、IL-18蛋白的表達對糖尿病腎病大鼠的腎臟起保護作用。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)逐漸成為我國慢性腎病發病的最主要原因。近年來許多研究[1-3]發現炎癥機制在DN發生發展中起重要作用。Toll樣受體-4(TLR4)在機體炎癥反應過程中發揮重要作用。TLR4可表達于腎小球足細胞和系膜細胞，與配體結合后，激活其信號傳導級聯反應，促進機體釋放如單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細胞介素-8(IL-8)等炎癥因子，加重蛋白尿，損傷腎臟。霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一種新型免疫抑制劑，能夠抑制機體炎癥反應，保護腎臟。作者觀察了霉酚酸酯對DN大鼠腎臟TLR4、IL-18表達的影響，探討DN的發病機制及MMF的治療機制。

1 材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠36只，體重200～275 g(鄭州大學實驗動物中心提供)。鏈脲菌素(STZ，美國Sigma公司)，MMF(杭州中美華東制藥有限公司)，兔抗大鼠TLR4多克隆抗體、兔抗大鼠IL-18多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，SP法試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，辣根酶標記的山羊抗兔IgG (美國Jackson公司)，PVDF轉印膜(美國Pall公司)，ECL化學發光試劑盒(美國Pierce公司)。

1.2實驗動物分組與標本采集36只大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為對照組(n=12)和DN組(n=24)。DN組給予腹腔一次性注射STZ 55 mg/kg造模。72 h后開始監測空腹血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型制作成功。3周后尿糖強陽性且24 h尿微量白蛋白排泄率>30 mg即為DN大鼠模型制作成功。造模成功的22只大鼠隨機分為模型組和治療組，每組11只。治療組每天給予MMF 15 mg/kg灌胃，余2組按體重每天給予相當量溶媒灌胃。標本收集：于12周末收集24 h尿液，采用全自動生化分析儀測24 h尿蛋白量。腹主動脈取血，測血糖(Glu)、肌酐(creatinine，Cr)、胱抑素(cystatin-C，Cys-C)。4 ℃、生理鹽水反復灌洗腎臟后，游離左腎，甲醛固定、梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋，用于腎組織形態學觀察。游離右腎，冰上取腎皮質切成小塊，立即置于液氮中，再轉入-70 ℃ 冰箱待測腎組織TLR4、IL-18。

1.3腎組織形態學觀察腎組織3 μm連續切片，常規脫蠟，行HE染色、PAS染色觀察腎組織大體形態學變化。

1.4腎組織TLR4和IL-18蛋白的免疫組化檢測

采用SP法。石蠟切片脫蠟水化后，體積分數3%H2O2處理內源性過氧化氫酶，抗原熱修復，山羊血清封閉后，分別滴加兔抗大鼠TLR4多克隆抗體(按1:100稀釋)、兔抗大鼠IL-18多克隆抗體(按1:100稀釋)。37 ℃孵化30 min,4 ℃過夜。加入生物素二抗室溫孵育30 min，滴加DAB顯色液，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。PBS代替一抗作陰性對照。棕黃色為陽性著色。德國 Lecia 顯微照像系統采集圖像，Biosens Digital Imaging System v1.6軟件分析圖像，每張切片高倍鏡下取20個視野，測定腎小球陽性區積分光密度值，取均值。

1.5腎組織TLR4、IL-18蛋白的Westernblot檢測稱取100 g腎組織置于裂解液中冰上勻漿，取上清，BCA法蛋白定量。取60 μg蛋白煮沸5 min，經120 g/L SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉溶液室溫搖床封閉1 h，加入兔抗大鼠TLR4、IL-18多克隆抗體(按1:1 000稀釋) ，4 ℃過夜孵育，TBST搖床洗膜10 min×3 次，辣根酶標記的山羊抗兔IgG(按1:4 000稀釋) 雜交，室溫孵育2 h，TBST 搖床洗膜10 min×3次，暗室中加ECL發光劑，曝光、顯影、定影，用圖像分析系統對雜交信號進行光密度掃描，用 QuantityOne 圖像分析軟件分析目標條帶的光密度值。

1.6統計學處理采用 SPSS 17.0處理數據。應用單因素方差分析比較3組大鼠腎組織各生化指標及TLR4和IL-18蛋白表達的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠生化指標比較12周時，與對照組比較，模型組和治療組24 h尿蛋白量，血Glu、Cr、Cys-C均升高；與模型組比較，治療組24 h尿蛋白量、血Cr、Cys-C均下降，模型組與治療組血Glu差異無統計學意義。 見表1。

表1 各組大鼠生化指標

*：與對照組比較,P<0.05；▲：與模型組比較，P<0.05。

2.2 3組大鼠腎臟病理改變及TLR4、IL-18蛋白的免疫組化染色結果腎組織HE染色顯示：與對照組比較，模型組腎小球體積增大，炎癥細胞浸潤增加；治療組較模型組有所改善。腎組織PAS染色顯示：與對照組比較，模型組腎小球體積增大，基底膜增厚，炎癥細胞浸潤增加；治療組較模型組有所改善(圖1)。TLR4在正常腎小球系膜細胞、足細胞少量表達。IL-18在正常腎小球系膜細胞少量表達。TLR4、IL-18在模型組的表達較對照組升高，TLR4、IL-18在治療組表達較模型組下降。見圖2、表2。

圖1 各組大鼠腎臟PAS染色結果(PAS，×400)

圖2 各組大鼠腎組織TLR4(A)、IL-18(B)蛋白的表達(SP, ×400)

表2 各組大鼠腎組織TLR4、IL-18蛋白的表達

*：與對照組比較,P<0.05；▲：與模型組比較，P<0.05。

2.3 3組大鼠腎組織TLR4、IL-18蛋白的Westernblot檢測結果見圖3、表3。

圖3 3組TLR4、IL-18蛋白的Western blot檢測結果

表3 各組大鼠腎組織中TLR4、IL-18蛋白的表達

*：與對照組比較,P<0.05；▲：與模型組比較，P<0.05。

3 討論

TLR4可在腎小球足細胞、包曼氏囊和系膜細胞表達。研究[4-5]發現TLR4可表達于足細胞，配體與TLR4結合后可使足細胞表達的TLR4明顯上調，加重腎小球損傷。此外，TLR4與熱休克蛋白60、硫酸乙酰肝素、纖維蛋白原、高遷移率族蛋白1等內源性配體結合后，通過髓樣分化因子88 (MyD88)依賴型和MyD88非依賴型2條通路進行信號轉導，激活NF-κB而導致瀑布式炎癥反應。NF-κB激活后可促進MCP-1等炎癥因子釋放增加，趨化中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞等向腎臟局部聚集，損傷腎小球濾過膜，加重蛋白尿，損傷腎臟。Liu等[6]研究證實TLR4通過激活炎癥反應在DN的發病過程中起重要作用。IL-18是一種具有多種生物學活性的細胞因子，能夠通過活化單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等不同細胞，在DN的發病機制中起重要作用。Elsherbiny等[7]研究表明活化的腎小球系膜細胞能夠分泌IL-18，促進系膜細胞增殖和釋放細胞因子，加劇炎癥細胞在腎小球內的聚集，損傷腎小球濾過膜。陳寶平等[8]研究顯示：DN患者血清IL-18 水平高于對照組，并與尿白蛋白排泄率呈正相關。該研究結果亦證實模型組大鼠腎臟TLR4、IL-18表達明顯升高，其機制可能為TLR4激活NF-κB導致瀑布式炎癥反應。

MMF是一種高選擇性免疫抑制劑，口服吸收后在體內形成霉酚酸，能夠特異性抑制淋巴細胞增殖。近年來研究[9-10]發現MMF對DN有明顯的治療作用，可通過減輕足細胞損傷，減少單核細胞和淋巴細胞浸潤等機制保護腎功能。該研究發現，MMF治療12周后，治療組腎臟病理較模型組明顯改善，這與張燕等[11]的研究結果相似。治療組大鼠24 h尿蛋白量、血Cys-C、Cr水平明顯降低。免疫組織化學及Western blot檢測發現模型組大鼠腎臟TLR4、IL-18表達降低，提示MMF可能通過降低DN大鼠腎臟TLR4的表達，進而降低IL-18的表達，減少尿蛋白，保護腎臟。MMF抑制TLR4表達的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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(2013-12-06收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of mycophenolate mofetil on expressions of TLR4 and IL-18 in kidneys of diabetic nephropathy rats

SHENPengxiao,WANGJiansheng，ZHAOYingying

DepartmentofNephrology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

diabetic nephropathy;mycophenolate mofetil;TLR4;IL-18；rat

Aim: To investigate the effects of mycophenolate mofetil(MMF) on the expressions of TLR4 and IL-18 in kidneys of diabetic nephropathy rats. Methods: SD rats were allocated into 3 groups: normal control group(n=12)，diabetic nephropathy group(model group,n=11)，and treatment group(n=11)．The latter 2 groups were established diabetic nephropathy model. The treatment group was given MMF at 15 mg/kg per day,and the other 2 groups were given the solvent.Twelve weeks later，kidney pathology was observed using HE staining and PAS staining．Immunocytochemistry and Western blot were used to detect the expressions of TLR4 and IL-18.Results: HE staining and PAS staining of nephridial tissue showed that glomerular volume，thickness of glomerular basement membrane and infiltration of inflammatory cells in the model group increased significantly compared with the normal control group． Improvements were observed in the treatment group． The differences in the expressions of TLR4 and IL-18 in nephridial tissue among three groups were statistically significant．The expressions of TLR4 and IL-18 in nephridial tissue in model group were higher than those in normal control group(P<0.05).Conclusion: The protective role of MMF may be associated with the decrease of TLR4 and IL-18 in diabetic nephropathy rats.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.011

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