沉默Fas和PKCδ表達對游離脂肪酸誘導的HUVEC凋亡的影響

蔡 威，周 逸，楊 鍇，陳曼華，楊飛燕

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院心內科 武漢 430014

沉默Fas和PKCδ表達對游離脂肪酸誘導的HUVEC凋亡的影響

蔡 威，周 逸，楊 鍇，陳曼華，楊飛燕#

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院心內科 武漢 430014

#通訊作者，女，1976年4月生，博士，副主任醫師，研究方向：冠心病發病機制，E-mail:feiyanyang@hotmail.com

PKCδ；Fas；游離脂肪酸；人臍靜脈內皮細胞；凋亡；siRNA

目的：探討Fas與PKCδ在游離脂肪酸(FFA)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)凋亡中的作用。方法①取對數生長期HUVEC，分為空白組，對照組，50、75、100 μmol/L FFA組及相應FFA+PKCδ siRNA轉染組，采用比色法檢測細胞增殖情況，Western blot檢測p-PKCδ蛋白的表達。②將HUVEC分為空白組，對照組，FFA組(100 μmol/L FFA處理)和FFA+PKCδ siRNA組，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。③取100 μmol/L FFA干預后的HUVEC分別轉染無關序列siRNA和Fas siRNA, 以未轉染細胞作空白對照，Western blot法檢測p-PKCδ和Fas蛋白的表達。結果①各組細胞增殖水平差異有統計學意義(F=20.863，P<0.001)，FFA可抑制細胞增殖(P<0.05)，而PKCδ siRNA能減弱FFA對細胞增殖的抑制(P<0.05)。各組細胞p-PKCδ蛋白的表達差異有統計學意義(F=229.072，P<0.001)，FFA能提高p-PKCδ蛋白的表達水平(P<0.05),而PKCδ siRNA可抑制FFA引起p-PKCδ蛋白的表達(P<0.05)。②各組細胞凋亡率差異有統計學意義(F=86.973，P<0.001)，FFA可增加細胞凋亡(P<0.05)，而PKCδ siRNA能降低FFA所致的凋亡(P<0.05)。③各組細胞Fas蛋白表達差異有統計學意義(F=122.162，P<0.001)，Fas siRNA可減低HUVECFas蛋白的表達(P<0.05)。結論FFA誘導的HUVEC凋亡可能由PKCδ涉及的Fas通路介導。

游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)在內皮細胞損傷所致的心腦血管疾病進展中扮演重要角色[1-3]。PKCδ已經被確定是多種細胞功能的關鍵介質，包括細胞增殖和凋亡[4-5]。PKCδ可誘導多種細胞凋亡，包括嗜中性粒細胞、角質形成細胞、神經元細胞、成纖維細胞、轉化細胞和心肌細胞[6]。前期報道[7-8]發現，PKCδ與Fas介導的凋亡有協同作用。該研究應用FFA藥物干預人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelium cell,HUVEC)，并應用RNA干擾技術在FFA干預條件下抑制PKCδ的表達，觀察沉默PKCδ的表達對FFA干預的HUVEC增殖和凋亡的影響；同時，應用RNA干擾技術沉默Fas蛋白，檢測Fas和PKCδ蛋白在FFA干預的HUVEC中的變化，旨在探討PKCδ和Fas與凋亡有關的相互作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑HUVEC購自武漢大學生物保存中心。DMEM高糖培養基、轉染用無血清Opti-MEMI培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司。FFA購自美國Sigma公司。Trizol和Transfection Reagent Lipofectamine 2000 購自美國 Invitrogen公司。cDNA 第一鏈合成試劑盒為加拿大 Fermentas公司產品。FAST SYBR購自美國ABI公司。應用 Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物序列，交上海生工生物工程公司合成。WST-1購自日本同仁化學公司。PKCδ siRNA、Fas siRNA、p-PKCδ、Fas和β-actin購自美國Santa Cruz公司。流式細胞學檢測試劑盒購自武漢啟動子生物公司。2.5 g/L胰蛋白酶，IP及WB蛋白提取液，BCA蛋白定量試劑盒和ECL發光試劑盒均購自江蘇碧云天公司。

1.2細胞培養HUVEC培養于含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基中，取對數生長期細胞用于實驗。FFA按文獻[9]報道的描述制備。HUVEC轉染前1 d，換用不含抗生素的新鮮培養基后，調整HUVEC密度為2×105mL-1，以每孔2 mL接種于6 孔板中培養過夜。

1.3熒光定量PCR檢測待細胞達到50%～70%融合時，分為3組：空白組，無關序列siRNA轉染組(對照組)和PKCδ siRNA轉染組，每組設3個復孔。按照Lipofectamine 2000說明書，使用無血清Opti-MEMI培養基進行細胞轉染，轉染4～6 h后用含有體積分數10%血清的DMEM高糖培養基，轉染48 h。應用Trizol裂解液提取細胞的總RNA，將1 μg的RNA逆轉錄成cDNA。熒光定量PCR反應體系為10 μL: 5 μL Fast SYBR, 3 μL滅菌去離子水, 1 μL cDNA模板和各0.5 μL的上、下游引物。目的基因mRNA的相對表達量=2-ΔCt,ΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)。

1.4細胞增殖能力的檢測取對數生長期HUVEC接種于96孔板，根據FFA藥物干預和PKCδ siRNA的轉染分為空白組，BSA對照(對照)組，50、75、100 μmol/L FFA組、50、75、100 μmol/L FFA+ PKCδ siRNA組，每組設3個復孔。FFA組分別給予相應濃度FFA處理，PKCδ siRNA轉染組在不同濃度FFA處理后待細胞融合達60%～70%后轉染PKCδ siRNA。依據 WST-1說明書，采用比色法測定細胞活力。每孔加入2 μL WST-1試劑, 37 ℃孵育2 h，在490 nm分光光度計檢測。

1.5細胞凋亡的檢測采用同樣的細胞培養法和轉染方法，將HUVEC分為空白組，BSA對照(對照)組，FFA組和FFA+PKCδ siRNA組，每組設3個復孔，FFA組細胞加入100 μmol/L FFA，FFA+PKCδ siRNA組細胞加入100 μmol/L FFA后轉染PKCδ siRNA。收集干預后的細胞，PBS洗滌3遍，用100 μL預冷的Binding緩沖液重懸細胞，加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻避光孵育15 min，再加入400 μL Binding緩沖液混勻后，上流式細胞儀檢測。計算細胞的凋亡率。

1.6細胞中p-PKCδ和Fas蛋白的Westernblot檢測將100 μmol/L FFA干預的HUVEC按以上方法接種于6孔板，分別轉染無關序列siRNA(對照組)和Fas siRNA,以未轉染的細胞作空白對照，每組設3個復孔。待轉染48 h后提取細胞蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度， Western blot 法檢測目的蛋白p-PKCδ和Fas表達量，一抗稀釋1 000倍，二抗稀釋5 000倍，使用ECL顯影液，曝光、顯影。同法檢測1.4實驗分組細胞中p-PKCδ蛋白的表達。利用Image J灰度分析軟件分析，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.7統計學處理采用SPSS 11.0進行數據分析。各組細胞PKCδ mRNA表達、細胞增殖、細胞凋亡率以及Fas和p-PKCδ蛋白表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞PKCδmRNA的表達見表1。

表1 各組細胞PKCδ mRNA的表達

F=36.839,P<0.001；*：與空白組和對照組比較，P<0.05。

2.2各組細胞增殖的水平見表2。FFA抑制了HUVEC的增殖，以100 μmol/L效果最明顯。轉染PKCδ siRNA后，FFA對細胞增殖的抑制能力減弱。

2.3各組細胞中p-PKCδ蛋白的表達見圖1和表2，加入FFA后，p-PKCδ蛋白的表達水平明顯增加，而在FFA干預的HUVEC中加入PKCδ siRNA后，p-PKCδ蛋白的表達水平明顯降低。

圖1 各組細胞中p-PKCδ蛋白的表達

1：空白組；2：對照組；3：50 μmol/L FFA組；4：75 μmol/L FFA組；5：100 μmol/L FFA組；6：50 μmol/L FFA+PKCδ siRNA組；7：75 μmol/L FFA+PKCδ siRNA組；8：100 μmol/L FFA+PKCδ siRNA組。

表2 各組細胞增殖能力和p-PKCδ蛋白的表達

*：與空白組和對照組比較，P<0.05；#：與各濃度FFA組比較，P<0.05。

2.4各組細胞凋亡的變化見表3。HUVEC加入FFA后，細胞凋亡率明顯增加，而在FFA干預的HUVEC中加入PKCδ siRNA后，細胞凋亡率降低。

表3 各組細胞凋亡率的比較 %

F=86.973,P<0.001;*：與空白組和對照組比較，P<0.05；#：與100 μmol/L FFA組比較，P<0.05。

2.5 3組細胞Fas蛋白和p-PKCδ蛋白表達的比較見圖2和表4。

圖2 3組細胞中Fas和p-PKCδ蛋白的表達

表4 3組細胞中Fas和p-PKCδ蛋白的表達

*：與空白對照組和對照組比較，P<0.05。

FFA干預后的HUVEC轉染Fas siRNA后，Fas蛋白的表達水平明顯降低，而p-PKCδ蛋白的表達水平無明顯改變。

3 討論

FFA誘導的內皮細胞凋亡已有相關報道。Li等[2]發現參與胰島素信號通路的Akt通路在HUVEC中可被高濃度的FFA抑制，進而導致凋亡。此外，目前的研究[10]已證實PKCδ活性與糖尿病相關的病理性血管新生及視網膜外膜細胞凋亡等密切相關。另外，研究[6]還發現FFA可以激活內皮細胞PKCδ的表達，且PKC家族積極參與了代謝及心血管疾病的發生發展過程[11]。該研究中，作者觀察到FFA干預可以降低HUVEC的增殖，但這種效應可通過轉染PKCδ siRNA沉默PKCδ表達逆轉。與此同時，作者還發現FFA誘導的凋亡可以被PKCδ siRNA轉染阻斷。以上結果提示PKCδ在FFA所致的內皮細胞功能失調中可能發揮著至關重要的調節作用。

凋亡過程中經常可以觀察到Fas-FasL信號通路的激活。研究[12-14]發現Fas-FasL信號通路在動脈粥樣硬化及糖尿病的內皮細胞功能受損中常常呈激活狀態，提示Fas-FasL信號通路可能參與了內皮細胞損傷及凋亡過程。然而極少有PKCδ與Fas-FasL信號通路在內皮細胞中潛在關系的研究。該研究中，FFA干預HUVEC可增加PKCδ激酶活性相關的p-PKCδ蛋白的表達；而Fas siRNA處理細胞后，在抑制Fas表達的同時，也抑制了FFA誘導的p-PKCδ蛋白的表達。以上結果提示Fas可能是FFA誘導的凋亡信號通路中PKCδ的下游信號分子，FFA引起的HUVEC凋亡可能由PKCδ誘導的Fas表達所介導，進而激活Fas-FasL信號通路，導致內皮細胞的損傷與凋亡。

綜上所述，PKCδ介導的FFA誘導的HUVEC增殖、凋亡可能是通過下游Fas信號實現的。在此基礎上，研究PKCδ和Fas與內皮細胞損傷的關系，將有助于進一步闡明FFA所致心腦血管疾病的分子機制，從而為心腦血管疾病的干預提供新的分子生物學靶點。

[1]Zhu P,Chen G,You T,et al.High FFA-induced proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial cell partly through Wnt/beta-catenin signal pathway[J].Mol Cell Biochem,2010,338(1/2):123

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(2013-11-05收稿 責任編輯李沛寰)

Role of PKCδ and Fas in free fatty acid-induced HUVEC cell apoptosis

CAIWei,ZHOUYi,YANGKai,CHENManhua,YANGFeiyan

DepartmentofCardiology,theCentralHospitalofWuhan,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014

PKCδ；Fas；free fatty acid；human umbilical vein endothelium cell；apoptosis；siRNA

Aim: To investigate the effect of PKCδ and Fas on free fatty acid-induced apoptosis in human umbilical vein endothelium cell(HUVEC). Methods: PKCδ siRNA was transfected into HUVEC, and RT-PCR was used to detect the expression of PKCδ mRNA.HUVEC cells were treated with blank， control, 50,75,100 μmol/L FFA and the corresponding PKCδ siRNA transfected groups.FFA groups were treated with 50, 75 and 100 μmol/L FFA, and PKCδ siRNA transfected groups were transfected with PKCδ siRNA after treatment with different concentrations of FFA. Colorimetric assay was used to determine cell proliferation, and Western blot was used to investigate the protein expression of p-PKCδ. HUVEC cells were classified into four groups: blank, control, FFA and FFA+PKCδ siRNA group. FFA group was treated with 100 μmol/L FFA, and FFA+ PKCδ siRNA group was transfected with PKCδ siRNA after treated with 100 μmol/L FFA. Flow cytometry was used to measure the apoptosis rate of the four groups. 100 μmol/L FFA treated HUVEC cells were transfected with unrelated sequence siRNA and Fas siRNA,the FFA treated HUVEC cells without siRNA transfection was used as the control. Western blot was used to investigate the protein expression of p-PKCδ and Fas. Results: The mRNA expression of PKCδ was decreased in cells transfected with PKCδ siRNA (F=36.839,P<0.001).Significant statistical difference was observed in cell proliferation between groups (F=20.863，P<0.001). FFA could significantly inhibit the proliferation of HUVEC cells (P<0.05), whereas PKCδ siRNA decreased the effect of FFA in HUVEC cells (P<0.05). Significant statistical difference was observed in protein expression of p-PKCδ between groups (F=229.072,P<0.001). FFA could upregulate the protein expression of p-PKCδ (P<0.05), while PKCδ siRNA could abolish this effect (P<0.05). Significant statistical difference was observed in cell apoptosis between groups (F=86.973，P<0.001). FFA could increase cell apoptosis (P<0.05), while PKCδ siRNA could abolish FFA induced apoptosis (P<0.05). Significant statistical difference was observed in protein expression of Fas between groups (F=122.162,P<0.001). Fas siRNA could significantly downregulate the protein expression of Fas in HUVEC cells (P<0.05). Conclusion: FFA-induced apoptosis in HUVEC cells may possibly mediate by PKCδ and involve in the upregulation of its downstream Fas.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.012

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