不同來源凍融精子行卵胞漿內單精子注射的臨床結局分析*

宋文妍，趙萬里，楊慶嶺，孫瑩璞，姚桂東，楊洪毅，金海霞，辛志敏

鄭州大學第一附屬醫院生殖中心 鄭州 450052

不同來源凍融精子行卵胞漿內單精子注射的臨床結局分析*

宋文妍△，趙萬里，楊慶嶺，孫瑩璞，姚桂東，楊洪毅，金海霞，辛志敏

鄭州大學第一附屬醫院生殖中心 鄭州 450052

△女，1973年1月生，博士，副主任醫師，副教授，研究方向：生殖醫學，E-mail:csxok@163.com

診斷性睪丸活檢；診斷性附睪活檢；凍融精子；卵胞漿內單精子注射

目的：探討不同來源凍融精子行卵胞漿內單精子注射(ICSI)的效果。方法回顧性分析因無精癥采用睪丸和附睪精子行ICSI的895個周期，其中診斷性附睪活檢凍融精子7個周期(A組)，診斷性睪丸活檢組織凍融11個周期(B組)，附睪穿刺取精(PESA) 行ICSI后剩余精子凍融13個周期(C組)，睪丸穿刺取精(TESA)行ICSI后剩余精子凍融12個周期(D組)，PESA新鮮精子630個周期(E組)，TESA新鮮精子222個周期(F組)。結果6組的平均MⅡ卵子數、平均優質胚胎數比較，差異均無統計學意義(F=0.326、1.513,P>0.05),優質胚胎率、種植率、臨床妊娠率差異亦沒有統計學意義(χ2=4.874、2.766、1.617，P>0.05)。結論不同來源凍融精子行ICSI可以獲得與新鮮精子相似的臨床結局。

采用顯微外科技術，如顯微外科附睪精子抽吸術(microsurgical epididymal sperm aspiration,MESA)、經皮附睪穿刺取精術(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)或睪丸精子抽取術 (testicular aspiration,TESA)，獲得附睪或睪丸精子，行卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)已經成為試管嬰兒的常規技術之一，它使無精癥患者擁有自己的遺傳學后代成為可能,因而無精癥患者的生育力保存也成為研究熱點之一。診斷性附睪和睪丸活檢凍融精子復蘇后用于ICSI，不僅可以保存生育力，還可以減少反復穿刺帶來的并發癥，但是相關報道較少，且均是應用冷凍精子[1-2]，直接凍融診斷性睪丸活檢組織取精用于ICSI的病例尚未見報道。作者回顧性分析、比較了凍存取卵日ICSI后剩余附睪及睪丸精子和直接冷凍診斷性穿刺附睪精子和睪丸組織用于ICSI的臨床結局，探討不同來源凍融精子用于ICSI的臨床有效性及安全性，旨在為臨床應用提供依據。

1 對象與方法

1.1研究對象選取 2007年9月至2013年9月因男方無精癥在鄭州大學第一附屬醫院生殖中心接受ICSI助孕的不孕癥患者為研究對象。納入標準：①男方至少經3次精液分析離心沉淀鏡檢未見精子，診斷性附睪活檢或病理報告有成熟精子。②不孕年限≤10 a。③夫婦雙方染色體均正常。④患者血清激素水平均在正常范圍。⑤女方無子宮畸形及卵巢低反應(取卵日獲卵數<4枚)，年齡<35歲，非多囊卵巢綜合征，無遺傳性及家族性病史。其中，應用診斷性附睪活檢精子凍融7個周期(A組)，診斷性睪丸活檢組織凍融11個周期(B組)，PESA行ICSI后剩余精子凍融13個周期(C組13)，TESA行ICSI后剩余精子凍融12個周期(D組)。以新鮮未冷凍精子852個周期為對照，其中PESA 630個周期(E組)，TESA 222個周期(F組)。

1.2PESA及精子冷凍常規行PESA。如果是診斷性附睪活檢，則將穿刺液直接冷凍；如果是取卵日附睪活檢，將精子處理后行ICSI，剩余精子冷凍保存。將準備冷凍的附睪穿刺液500 g離心10 min，棄上清液，僅留少量培養液與沉淀混勻后按體積比1:1加入冷凍保護劑(美國 Quin′s產品)。常規每個患者凍存2管。將凍存管于室溫靜置10 min，4 ℃放置 15 min，液氮蒸汽內放置15 min后放入液氮冷凍保存。

1.3TESA及睪丸組織、精子冷凍常規行TESA。如果是診斷性睪丸活檢，則將曲細精管取出后一部分送病理檢查，另一部分直接冷凍。如果是取卵日睪丸組織活檢，穿刺液中若有活動精子，則將精子處理后行ICSI，剩余精子予以冷凍；若未見活動精子，則將懸液置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養后觀察，一般會見精子活力明顯加強，只要見到有活動精子就予以凍存。睪丸組織的冷凍：按體積比1:1 加入精子冷凍保護劑(美國Quin′s產品)，冷凍管內靜置5 min，待睪丸組織與保護劑充分混勻，液氮中懸吊15 min后投入液氮冷凍保存。 精子冷凍：方法同1.2。

1.4冷凍精子的復蘇女方取卵當日，從液氮中取出凍存管，迅速投入37 ℃水浴10 min，融解后倒置顯微鏡下觀察，若有活動精子，則用精子分離液(Spermrinse液，美國 Quin′s產品)常規洗滌精子2 遍，2 次離心后再次加入Spermrinse液，轉移入培養皿行ICSI。如復蘇后無活精子，則重新行PESA 或 TESA，并歸入E組或F組。

1.5冷凍睪丸組織的復蘇女方取卵當日，從液氮中取出冷凍管迅速投入37 ℃水浴10 min，融解后先用1 mL注射器分開曲細精管，清洗2～3遍，盡量多地去除紅細胞，然后用兩只折彎角度為90°的1 mL 注射器針頭將精子從曲細精管中擠出至0.6 mL培養液中，取出反復擠壓過的曲細精管，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養1～2 h,若有活動精子，直接離心后行ICSI。若無活動精子檢出，則再次行PESA或TESA，并歸入E組或F組。

1.6超促排卵、取卵、受精及胚胎移植根據患者年齡、基礎竇卵泡數及月經周期第3天FSH、LH及E2水平，均選用長方案超排卵[3]。從月經周期第22天采用達必佳垂體降調，于月經周期第3天注射果納芬和HMG促排卵，B超監測卵泡發育情況，監測血清LH及E2水平，至少有兩個優勢卵泡直徑達18 mm時肌內注射HCG 10 000 IU，36 h后取卵。取出卵冠丘復合物立即放入培養液，3～4 h后選取MⅡ卵子行ICSI[4]。以雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵。第2或第3天選擇1～3個Ⅱ級優質胚胎進行移植。<35歲者移植2個，≥第2周期移植3個胚胎，≥第2周期行激光輔助孵出。

1.7觀察指標①相關指標的計算：受精率=正常受精卵數/ICSI卵數×100%。卵裂率=卵裂胚胎數/正常受精卵數×100%。種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%。臨床妊娠率=妊娠周期數/移植周期數×100%。②臨床宮內妊娠：若移植術后第14、18日測血β-HCG陽性，則第35日B超觀察宮腔內孕囊數目和心管搏動以確定臨床妊娠。黃體支持直至妊娠第12周。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0進行數據處理，6組間平均MⅡ卵子數、平均優質胚胎數、平均移植胚胎數的比較采用單因素方差分析，6組間受精率、2PN卵裂率、優質胚胎率、種植率及臨床妊娠率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 6組患者的一般情況的比較見表1。6組患者的平均MⅡ卵子數、平均優質胚胎數、平均移植胚胎數比較，差異均無統計學意義。

表1 6組患者平均MⅡ卵子數、平均優質胚胎數、平均移植胚胎數比較

2.2 6組患者妊娠結局的比較見表2。

表2 6組ICSI臨床結局的比較

3 討論

3.1凍融精子來源的選擇大多數文獻[2，5]報道附睪精子經冷凍復蘇后行ICSI能取得與新鮮附睪精子相似的臨床結局。該研究結果顯示，取卵日ICSI后剩余附睪精子(C組)和診斷性活檢附睪精子(A組)凍融用于ICSI的臨床結局差異無統計學意義，與文獻報道相似。目前睪丸精子凍融用于ICSI的臨床結局文獻報道尚有爭議。雖然絕大多數文獻[6-7]提示睪丸精子經冷凍復蘇后行ICSI能取得與新鮮睪丸精子相似的受精率及臨床妊娠率；但是也有文獻[8-10]報道，凍存后睪丸精子的受精能力明顯提高，但是復蘇率較低，不能保證臨床應用，且冷凍過程對睪丸精子的染色體也可能有損傷。但該研究結果提示，無論是診斷性睪丸活檢組織來源的精子(B組)，還是取卵日ICSI后剩余的睪丸精子(D組)，冷凍均沒有降低其發育潛能。

如何選擇凍融附睪及睪丸精子，目前也尚無定論。該研究結果顯示，雖然6組受精率及2PN卵裂率差異有統計學意義，但是與新鮮精子相比，不同來源的凍融精子的ICSI臨床結局差異均無統計學意義。原因可能是冷凍復蘇會使附睪或睪丸精子胞漿空泡增多、細胞核和胞質膜皺縮或腫脹、膜斷裂、頂體受損等，但冷凍也間接起到了一種篩選的作用，清除了大部分有缺陷的精子，只有那些活動力較好、膜功能穩定、代謝旺盛、染色體正常的精子才能經受住低溫而得以保全[11]，因此對臨床結局影響不大。

3.2冷凍附睪精子或睪丸組織的優點近年來，凍融診斷性活檢附睪或睪丸精子用于ICSI逐漸應用于臨床，而且取得了與新鮮附睪或睪丸精子相近的臨床結果。目前文獻報道的均是冷凍診斷性的附睪及睪丸精子懸液，而直接冷凍診斷性的睪丸活檢組織，并將其解凍后用于臨床尚未見報道。該研究中，作者凍融診斷性附睪穿刺獲得的精子10個周期，7個復蘇成功并應用于ICSI；同時直接冷凍診斷性睪丸活檢組織17個周期，其中有11個周期解凍后活精用于ICSI，在復蘇率、受精率、卵裂率及臨床妊娠率方面與新鮮精子相近。以上結果證實凍融診斷性活檢附睪精子或睪丸組織是一種診斷與治療有機結合的經濟有效的治療方法，有以下優點：①增加了新鮮睪丸組織的利用率，最大限度地保留了患者的遺傳物質。②減輕了反復外科手術取精給患者帶來的精神和經濟負擔。③減少了對睪丸尤其是體積小的睪丸的損傷。④有效地防止了在取卵當日因外科手術取精失敗而放棄本周期治療情況的發生。

總之，該研究結果證實，不同來源凍融精子行ICSI可以獲得與新鮮精子相似的臨床結局，是無精癥患者生育力保存的有效方法，冷凍診斷性活檢附睪精子和睪丸組織也是減少患者反復穿刺損傷的最佳選擇。

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(2014-02-26收稿 責任編輯王 曼)

Clinical ICSI outcome with different sources of frozen-thawed sperm

SONGWenyan,ZHAOWanli,YANGQingling,SUNYingpu,YAOGuidong,YANGHongyi,JINHaixia,XINZhimin

ReproductiveCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

diagnostic puncture of testicular;diagnostic puncture of epididymal;frozen-thawed sperm;intracytoplasmic sperm injection

Aim: To investigate the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection(ICSI) with different sources of frozen-thawed sperm. Methods: A total of 895 ICSI cycles were evaluated retrospectively.There were 7 cycles using frozen-thawed sperm after diagnostic puncture of epididymis, 11 cycles using frozen-thawed sperm after diagnostic puncture of testis, 13 cycles using frozen-thawed sperm from PESA after ICSI, 12 cycles using frozen-thawed sperm from TESA after ICSI, 630 cycles using the sperm from PESA and 222 cycles using the sperm from TESA.Results: The differences in the median numbers of MⅡ orum and high quality embtyo among the 6 groups had no statistical significance(F=0.326,1.513,P>0.05).Conclusion: The clinical outcome of ICSI with frozen-thawed testicular or epdidymal sperm is similar to that of ICSI with fresh epididymal or testicular sperm.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.027

*鄭州市科技攻關項目 340600531425

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