復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎保護作用的研究

曾潔 王素軍 楊本坤 鐘運鳴 臧林泉

·論著·

復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎保護作用的研究

曾潔 王素軍 楊本坤 鐘運鳴 臧林泉

目的探討復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠慢性腎衰竭模型的腎臟保護作用及其可能的機制。方法大鼠行5/6腎切除術制造動物模型，造模成功后給藥，于給藥前及給藥后4、8、12周采集樣本，測定24 h尿蛋白、血尿素氮、血清肌酐的量及轉化生長因子-β1(TGF-β1) mRNA在腎的表達。結果復方何首烏飲能顯著性地降低24 h尿蛋白排泄量(P<0.05)，降低血尿素氮、血清肌酐含量(P<0.05)，同時抑制大鼠腎TGF-β1 mRNA的表達(P<0.05)。結論復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎具有保護作用，其可能的機制為抑制TGF-β1 mRNA的表達。

復方何首烏飲；5/6腎切除術；慢性腎衰模型

慢性腎衰(CRF)的病理基礎是腎小球硬化、腎纖維化。腎纖維化幾乎又是所有腎臟疾病慢性化病程進展到終末期腎病的共同通路[1]。王偉銘等[2]認為轉化生長因子(TGF-β1)可能通過促進腎間質成纖維細胞膠原的合成及 mRNA的表達而參與腎間質纖維化。沈延春等[3]對5/6腎切除大鼠腎臟病理學動態變化進行研究，證實了5/6腎切除模型符合人類腎纖維化的病理改變，是研究慢性腎衰竭、腎纖維化的理想動物模型。已有研究顯示，復方何首烏飲能改善衰老大鼠腎臟的形態學結構，具有減少腎小球和腎小管間質纖維化的作用[4]。裴華穎等[5，6]證實了纈沙坦能延緩CRF患者腎功能減退的進展，Noda等[7]證實了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類藥物坎地沙坦可以抑制5 /6腎切除大鼠腎組織TGF-β1的表達，且認為血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑對對5/6腎切除大鼠腎保護作用比血管緊張素Ⅰ轉化酶抑制劑效果好。因此本實驗設計纈沙坦組為陽性對照組，探討復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎保護作用，并觀察轉化TGF-β1 mRNA在腎的表達情況。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠80只，體重 200～250 g，廣東中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號scxk(粵)2008-0020。

1.2 藥物 復方何首烏飲藥材[何首烏(炙)、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓]購自廣州采芝林連鎖藥店，經廣東藥學院王桂香老師鑒定所購藥材均符合《中華人民共和國藥典》2010年版標準。復方何首烏飲方劑組成：何首烏15 g，肉蓯蓉10 g，懷牛膝15 g，淫羊藿10 g，丹參25 g，茯苓15 g，混合粉碎，加水800 ml，超聲1 h，然后水煎2次，各30 min，過濾，合并濾液，濃縮至生藥質量濃度為6 g/ml。

1.3 試劑與儀器 Trizol(晶美生物工程有限公司)；引物(大連TaKaRa公司)；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(武漢博士德生物有限公司)。紫外可見分光光度計(日本島津公司)，HF-240 全自動生化分析儀(泰諾科貿有限公司)PCR擴增儀(上海領成生物科技有限公司)，電泳裝置(BioRad 公司)。

1.4 模型建立 大鼠56只適應性喂養1周，隨機分為假手術組(12只)和手術組(44只)。手術方法[8]：20%烏拉坦(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，俯臥位固定于鼠臺上，選取背左側切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，將腎的上下極各1/3切除，明膠海綿壓迫切面止血，復位腎臟，縫合。1周后第2次手術行右腎切除，2次手術共切除5/6個腎臟。假手術組先后兩次手術均暴露腎臟，分離腎周圍脂肪囊，不做切腎處理。將手術成功的36只大鼠隨機分3組，分別為模型對照組、復方何首烏飲組、纈沙坦組，每組12只。

1.5 給藥方法及標本留取 假手術組和模型對照組給予等體積的蒸餾水，纈沙坦組、復方何首烏飲組低、中、高劑量組各分別按20 mg/kg，1、2、2.5 ml/d灌胃給藥，每天1次，連續12周。分別于給藥前及給藥后4,8,12周采集24 h 尿液，用于測定尿蛋白總量；眼眶取血，用于測定血清中尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)；12周末次給藥24 h后，脫頸椎法處死大鼠，留取大鼠腎組織，置于液氮中保存，用RT-PCR法檢測TGF-β1 mRNA在腎組織中的表達。

1.6 生化指標檢測 用考馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白含量(24 h UPE)；生化分析儀測定血清中尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)的含量。

1.7 TFG-β1 mRNA表達的檢測 按說明書用Trizol法提取組織總的RNA，取總RNA 2 μg，加入引物，經逆轉錄酶催化合成第一條cDNA，并以此為模板進行擴增。TGF-β1引物序列如下：上游5’- CAC CAT CCA TGA CAT GAA CC- 3’，下游5’-TCA TGT TGG ACA ACTG CTC C-3’；內參采用β-Actin：上游5’- ATG CCA TCC TGC GTC TG- 3’，下游5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT-3’。反應條件：94℃預變性2 min，隨后94℃變性30 s，57℃復性30 s，72℃延伸30 s，共循環30次，最后72℃終延伸5 min。設置PCR擴增儀的熱蓋溫度為105℃。2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，用Qautity One 軟件分析假手術組、模型組、復方何首烏飲組及纈沙坦組的目的基因(TGF-β1)與內參照(β-actin)的PCR產物灰度值，以二者比值來表示目的基因mRNA的相對表達量表示。

1.8 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，樣本均數的比較采用One-Way ANOVA(單因素方差分析)分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復方何首烏飲對CRF大鼠生化指標的影響 實驗前4組大鼠的BUN、Scr及24 h UPE差異無統計學意義(P>0.05)。第4、8、12周末時模型對照組、復方何首烏飲低、中、高劑量組及纈沙坦組大鼠的BUN、Scr及24 h UPE水平較假手術組顯著升高(P<0.01)。復方何首烏飲低、中、高劑量組、及纈沙坦組大鼠的BUN、Scr及24 h UPE水平在第4、8、12周末時均低于模型對照組(P<0.05)；復方何首烏飲組中劑量給藥大鼠的各生化指標水平與纈沙坦組大鼠的各生化指標水平差異無統計學意義(P>0.05)。復方何首烏飲降低BUN、Scr及24 h UPE的作用具有濃度依賴性，高濃度具有更強的作用，且低、中、高劑量之間的抑制作用差異有統計學意義(P<0.05)。4組大鼠的BUN、Scr及24 h UPE的變化情況見圖1～3。

圖1 復方何首烏飲對模型大鼠血清BUN含量的影響

圖2 復方何首烏飲對模型大鼠血清Scr含量的影響

圖3 復方何首烏飲對模型大鼠24 h UPE含量的影響

2.2 復方何首烏飲對大鼠腎TGF-β1基因表達的影響 RT-PCR結果顯示，與假手術組比，模型對照組、復方何首烏飲組、纈沙坦組大鼠腎組織中TGF-β1mRNA表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組相比較，復方何首烏飲低、中、高劑量組、纈沙坦組大鼠腎組織中TGF-β1mRNA表達量顯著減少(P<0.05)；復方何首烏飲抑制腎組織TGF- β1 mRNA表達作用具有濃度依賴性，高濃度具有更強的抑制作用，且低、中、高劑量之間的抑制作用差異有統計學意義(P<0.05)；復方何首烏飲中劑量組抑制腎組織TGF-β1mRNA表達量與纈沙坦組抑制腎組織TGF-β1mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖4 復方何首烏飲對大鼠腎TGF-β1 mRNA表達的影響

圖5 復方何首烏飲對大鼠腎TGF-β1 mRNA表達的影響

3 討論

慢性腎衰竭是各種腎病持續發展的最終結局，臨床表現為腎功能減退，水、電解質、酸堿代謝紊亂；病理學表現為腎小球硬化和腎間質纖維化。Barata等[9]探討了5/6腎切除后大鼠體內的生理變化。結果顯示從2周開始，大鼠腎功能作用減弱，肌酐清除率下降，水、電解質的重吸收減少，尿蛋白排泄量增加，且隨著時間的推移，腎功能的作用逐漸惡化。

本文以尿素氮、血清肌酐及24 h尿蛋白的量作為腎功能的考察指標，研究復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎保護作用。由結果圖1,2可知，復方何首烏飲能顯著地降低大鼠尿素氮及血肌酐的量。TGF-β1是目前公認的致纖維化因子，是一種調節細胞生長和分化的多肽[10]。當機體組織損傷后，TGF-β1可以被許多炎性細胞介導合成并釋放，活化的TGF-β1促使成纖維細胞增殖和聚集及促使成纖維細胞表型向成肌纖維細胞表型轉化，而成肌纖維細胞參與沉積，在腎纖維化發病機制中起著重要作用[11]。由實驗結果圖4可知，復方何首烏飲低、中、高劑量組大鼠腎TGF-β1 mRNA的表達與模型對照組相比明顯減少(P<0.05)，意味著復方何首烏飲可能通過抑制腎TGF-β1 mRNA的表達，從而起到延緩腎臟衰竭，保護腎組織。復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎保護作用具有濃度依賴性，隨著濃度的增大，腎保護作用增強，同時毒性也增大，《中國藥典》2010年版推薦制首烏給藥量為6～12 g。由實驗結果可知，復方何首烏飲中劑量給藥降低BUN、Scr、24 h UPE的量及其抑制腎組織中TGF-β1 mRNA的表達作用與纈沙坦組沒有顯著性差異，也即是復方何首烏飲中劑量給藥與纈沙坦對5/6腎切除大鼠腎保護作用具有等效，因此，綜合藥效性及安全性考慮，認為復方何首烏飲按中劑量給藥較為合理。復方何首烏飲的組方何首烏經炮制加工后具有補肝腎、益精血、烏須發等作用；肉蓯蓉始載于《神農本草經》，被列為上品，具有補肝腎、益精血、潤腸通便之功效；懷牛膝為莧科多年生草本植物的根，具有補益肝腎、活血祛瘀等作用；淫羊藿不僅可以補腎陽、強筋骨、祛風濕，而且還有抗衰老、提高免疫功能、抑制腫瘤等功效；現代藥理學研究表明，丹參具有抗菌消炎，改善腎功能的作用；茯苓具有利水滲濕、健脾寧心，增強免疫力之功效[12-15]。

綜上所述，復方何首烏飲可以從多個方面發揮益腎之功效。復方何首烏飲對5/6腎切除大鼠腎具有保護作用，其可能的機制為抑制TGF-β1 mRNA的表達，但復方何首烏飲中那一成分發揮作用，還有待于進一步研究。

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ProtectiveeffectofcompoundrecipeHeshouwuyinonkidneyof5/6nephrectomizedrats

ZENGJie,WANGSujun,YANGBenkun,etal.DepartmentofClinicalPharmacy,GuangdongCollegeofPharmacy,Guangzhou510006,China

ObjectiveTo investigate the protective effect of compound recipe Heshouwuyin on kidney of chronic renal failure (CRF) rats and its possible mechanism.MethodsThe rats were 5/6 nephrectomized to establish animal models,after the models were successfully established,the rats were administrated.The specimens were collected before medication and 4,8,12 weeks after administration,then 24h urine protein quantity,BUN,Scr were detected,in additional,the expression levels of TGF-β1 mRNA in kidney were determined.ResultsThe compound recipe Heshouwuyin could significantly decrease 24h urine protein quantity,the levels of Scr and BUN (P<0.05),meanwhile,which could inhibit the expression of TGF-β1 mRNA in nephridial tissue (P<0.05).ConclusionThe compound recipe Heshouwuyin has protective effect on kidney of CRF rats,and the action mechanism may be related with its inhibitory effect on expression of TGF-β1 mRNA.

compound recipe Heshouwuyin;5/6 nephrectomy;chronic renal failure model

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.001

項目來源：國家自然科學基金(編號：81073141)；廣東省自然科學基金(編號：9152402301000007)；科技部新藥重大專項(編號：2011ZX09102-001-31)；廣東省“十二五”醫學重點學科

510006 廣州市，廣東藥學院臨床藥學系

王素軍，510006 廣東藥學院臨床藥學系；

E-mail：wsj7272@126.com

R 961

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1002-7386(2014)13-1925-03

2014-01-20)