環磷酰胺對腫瘤微環境調節作用的研究

問明 馬振峰 張卓奇 崔乃鵬 溫軍業

·論著·

環磷酰胺對腫瘤微環境調節作用的研究

問明 馬振峰 張卓奇 崔乃鵬 溫軍業

目的觀察環磷酰胺(CTX)對黑色素瘤小鼠動物模型腫瘤微環境的干預及抗瘤作用。方法應用黑色素瘤細胞B16細胞株皮下接種制備荷黑色素瘤的小鼠動物模型。將不同劑量的CTX分別對不同組的小鼠模型進行腹腔注射，流式細胞術檢測小鼠脾淋巴懸液中中Treg 的含量，篩選CTX最佳劑量。應用流式細胞術檢測最佳劑量CTX腹腔注射后Treg水平的動態變化。應用 ELISA 法檢測小鼠血清中IL-10、TGF-β水平的動態變化。定期測量腫瘤大小繪制出腫瘤的生長曲線。結果CTX腹腔注射的最佳劑量為100 mg/kg，腹腔注射CTX后Treg水平及IL-10、TGF-β水平均出現下降后再緩慢升高的波動趨勢，低劑量CTX腹腔注射后不影響腫瘤的生長。結論低劑量CTX腹腔注射可以有效的調節腫瘤微環境，同時不影響荷瘤小鼠腫瘤的生長。

CTX；黑色素瘤；腫瘤微環境；Treg；IL-10；TGF-β

惡性腫瘤來源于機體正常細胞的突變，其發生與發展同宿主的機體免疫功能關系密切。機體通過免疫系統的免疫監視功能，針對突變的細胞產生一系列的免疫應答反應，從而實現對突變細胞的清除。然而在機體腫瘤發生及發展的過程中，體內腫瘤的微環境隨之發生改變，進而維持腫瘤組織能夠進一步生長[1,2]。存在于腫瘤微環境中的各種免疫抑制性細胞及抑制性細胞因子造就了腫瘤病變局部的免疫抑制性微環境，在腫瘤的發生發展、轉移侵襲等方面發揮著重要作用。其中Treg細胞是腫瘤患者機體微環境中引起腫瘤免疫耐受的主要因素之一。同時IL-10、TGF-β1、VEGF 等細胞因子，可以擴增胸腺來源的天然 Treg并可誘導產生出更多的Treg細胞。研究顯示腫瘤患者的Treg比例顯著升高，與預后呈現負相關關系[3]。Treg細胞在T細胞中的比例可以反映出腫瘤微環境的變化狀態。因此，對于Treg 水平進行調控成為目前腫瘤微環境干擾的研究熱點。本研究通過觀察低劑量CTX 對荷瘤小鼠 Treg細胞水平的影響探尋CTX應用的最佳劑量，并觀察CTX對Treg水平及IL-10、TGF-β1水平的調控的動態變化情況，來評判CTX對于腫瘤微環境的干擾能力，為腫瘤免疫治療研究提供更為詳實的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與腫瘤細胞株 健康的雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證編號：SCXK 京 2009-0004)。黑色素瘤細胞B16F10細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠調節性 T 細胞流式檢測試劑盒美國eBioscience 公司，注射用 CTX 購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號：08012021)；RPMI1640 培養基購自美國GIBCO公司；胎牛血清(FCS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，轉化生長因子β1(TGF-β1)Elisa kit、白介素10(IL-10)Elisa kit 美國R&D Systems公司，流式細胞儀美國Beckman Coulter公司，酶標儀美國 Thermo Electron公司

1.3 黑色素瘤荷瘤小鼠模型的建立 取對數生長期的黑色素瘤細胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，調整濃度至 1×106/ml，取瘤細胞混懸液 0.2 ml(含2×105個細胞)接種于小鼠背部皮下，觀察小鼠局部注射區域出現腫瘤即成功建立黑色素瘤荷瘤小鼠模型。

1.5 環磷酰胺(CTX)腹腔注射后Treg水平及IL-10、TGF-β水平的動態變化 選取荷瘤成功小鼠，隨機分為2組，A組荷瘤小鼠給予CTX腹腔注入(應用最佳劑量)(其中A1組小鼠定期處死用于Treg及血清IL-10、TGF-β水平檢測，A2組小鼠用于繪制生存曲線)，B組荷瘤小鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射作為對照組(其中B1組小鼠定期處死用于Treg及血清IL-10、TGF-β水平檢測，B2組小鼠用于繪制生存曲線)。分別于環磷酰胺注射前d0、注射后d1，d4，d7，d11和d15取A1及B1組相應小鼠各5只，摘眼球取外周血留取血清備ELISA檢測，隨后脫頸處死小鼠剖腹取出脾臟，制備脾細胞懸液流式檢查Treg水平。腹腔注射CTX組及對照組小鼠均每2天使用游標卡尺測量小鼠體表瘤體的長徑(a)和短徑(b)，按照公式V=1/6π(ab2)計算腫瘤體積，進而繪制腫瘤生長曲線，對比CTX注射組及NS注射組腫瘤生長情況的差異。

2 結果

表1不同劑量CTX注射組荷瘤小鼠脾淋巴細胞懸液中Treg/CD4+的比例

組別Treg/CD+40mg/kg組25.78±0.9150mg/kg組15.07±1.12100mg/kg組4.56±1.05200mg/kg組10.93±1.75

2.2 環磷酰胺(CTX)腹腔注射后Treg水平及IL-10、TGF-β水平的動態變化

2.2.1 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠Treg 細胞水平的影響：流式細胞學檢測結果顯示，與CTX腹腔注射前相比，CTX腹腔注射后荷瘤小鼠脾臟中Treg 細胞比例明顯下降，并于注射后第4天降至最低水平。見圖1。

圖1 CTX腹腔注射后Treg水平的動態變化

2.2.2 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠血清 IL-10 水平的影響：經ELISA 檢測，結果顯示，小鼠血清 IL-10 水平隨荷瘤出現升高，CTX腹腔注射后，荷瘤小鼠模型血清中 IL-10水平較注射前出現下降，于注射后第4天水平降至最低水平。見圖2。

2.2.3 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠血清TGF-β 水平的影響：經ELISA 檢測，結果顯示，小鼠血清TGF-β 水平隨荷瘤出現升高，CTX腹腔注射后，荷瘤小鼠模型血清中TGF-β水平較注射前出現下降，于注射后第7天水平降至最低水平。見圖3。

2.3 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 給予CTX腹腔注射后檢測腫瘤生長情況，繪制腫瘤體積變化曲線，與對照組比較，腫瘤體積變化無明顯差異。見圖4。

3 討論

圖2 CTX腹腔注射后IL-10水平的動態變化

圖3 CTX腹腔注射后TGF-β水平的動態變化

圖4 CTX腹腔注射后對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

我們繼續應用100 mg/kg CTX對荷瘤小鼠進行腹腔注射，進一步試驗發現經過注射后小鼠脾臟中Treg 細胞比例及血清中IL-10、TGF-β水平下降，且對于腫瘤微環境中免疫抑制因素的下調作用可以持續一定時間，有利于增強移植物的抗腫瘤效應(graft-versus-tumor effect)的發揮，同時與對照組對比發現，依照100 mg/kg給予CTX腹腔注射對于荷瘤小鼠腫瘤生長未見明顯影響，提示100 mg/kg的CTX干擾微環境作為過繼性回輸的預處理，在改善腫瘤局部微環境的同時并不會對效應細胞療效的評價產生影響。

總之，本研究提示低劑量CTX腹腔注射可以有效的調節腫瘤微環境，同時不影響荷瘤小鼠腫瘤的生長，為腫瘤免疫治療相關研究中CTX在腫瘤微環境調節中的應用提供了更為詳實的實驗依據。

1 Dougherty GJ,Dougherty ST.Exploiting the tumor microenvironment in the development of targeted cancer gene therapy.Cancer Gene therapy,2009,16:279-290.

2 Pang YL,Zhang HG,Peng JR et al.The immunosuppressive tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma.Cancer Immunol Immunother,2009,58:877-886.

3 Curiel TJ.Tregs and rethinking cancer immunotherapy.J Clin Invest,2007,117:1167-1174.

4 Lutsiak MEC,Semnani RT,De Pascalis R,et al.Inhibition of CD4+CD25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cyclophosphamide.Blood,2005,105:2862-2868.

5 Lord EM,Penney DP,Sutherland RM,et al.Morphological and functional characteristics of cells infiltrating and destroying tumor multicellular spheroids in vivo.Virchows Archiv,1979,31:103-116.

6 Naumov GN,Folkman J,Straume O.Tumor dormancy due to failure of angiogenesis:role of the microenvironment.Clinical & experimental metastasis,2009,26:51-60.

7 Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol,1995,155:1151-1164.

8 Schabowsky RH,Madireddi S,Sharma R,et al.Targeting CD4+CD25 +FoxP3 + regulatory T-cells for the augmentation of cancer immunotherapy.Curr Opin Investig Drugs,2007,8:1002-1008.

9 Burocchi A,Pittoni P,Gorzanelli A,et al.Intratumor OX40 stimulation inhibits IRF1 expression and IL-10 production by Treg cells while enhancing CD40L expression by effector memory T cells.European journal of immunology,2011,41:3615-3626.

10 D’Alise AM,Ergun A,Hill JA,et al.A cluster of coregulated genes determines TGF-beta-induced regulatory T-cell (Treg) dysfunction in NOD mice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,108:8737-8742.

11 Lundqvist A,Mc Coy JP,Samsel L,et al.Reduction of GVHD and enhanced antitumor effects after adoptive infusion of alloreactive Ly49-mismatched NK cells from MHC-matched donors.Blood,2007,109:3603-3606.

12 Hatiboglu MA,Kong LY,Wei J,et al.The tumor microenvironment expression of p-STAT3 influences the efficacy of cyclophosphamide with WP1066 in murine melanoma models.International Journal of Cancer,2012,131:8-17.

13 Motoyoshi Y,Kaminoda K,Saitoh O,et al.Different mechanisms for anti-tumor effects of low-and high-dose cyclophosphamide.Oncol Rep,2006,16:141-146.

14 Matsushita N,Pilon-Thomas SA,Martin LM,et al.Comparativemethodologies of regulatory T cell depletion in a murine melanoma model.J Immunol Methods,2008,333:167-179.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.007

071000 河北省保定市，河北大學附屬醫院腫瘤科(問明、馬振峰、張卓奇、崔乃鵬);河北省人民醫院外科(溫軍業)

R 979.1

A

1002-7386(2014)13-1942-04

2014-02-20)