γ干擾素釋放試驗(yàn)對活動性結(jié)核病診斷價(jià)值研究

李秦 孫沛 王波 張金花

·論著·

γ干擾素釋放試驗(yàn)對活動性結(jié)核病診斷價(jià)值研究

李秦 孫沛 王波 張金花

目的探討γ干擾素釋放試驗(yàn)對結(jié)核病的診斷價(jià)值，為提高結(jié)核病診斷技術(shù)提供依據(jù)支持。方法用上海復(fù)興T-SPOT．TB試劑檢測結(jié)核和非結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行γ干擾素釋放釋放試驗(yàn)，并計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果TB-IGRA診斷結(jié)核病敏感度為0.849，特異度為0.585，假陽性率為0.415，假陰性率為0.151，準(zhǔn)確率為0.787。結(jié)論TB-IGRA診斷結(jié)核病具有較高的敏感度和特異度，可以作為診斷結(jié)核病的較強(qiáng)的輔助技術(shù)。

結(jié)核病；γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)；診斷性試驗(yàn)

目前在結(jié)核病的防治中，最大的難題依然是結(jié)核病的診斷問題，結(jié)核病確診依據(jù)仍然是抗酸桿菌培養(yǎng)或涂片鏡檢，但結(jié)核桿菌培養(yǎng)周期長達(dá)2～4周，使得結(jié)核病漏診和誤診率一直較高。涂片鏡檢多限于痰和腦脊液標(biāo)本，而且受治療及取材過程影響很大，陽性率也很低。21世紀(jì)初期，Lalvani等首先應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測方法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)檢測外周血結(jié)核菌抗原特異性γ干擾素釋放水平來診斷結(jié)核菌感染，又稱γ干擾素釋放試驗(yàn)(interfer-on-gamma release assays,IGRA)[1]。2003年，英國牛津大學(xué)Chapman利用結(jié)核病患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞受到相應(yīng)的特異性抗原刺激(ESAT-6和CFP10的部分多肽片段)時(shí)分泌干擾素-γ的特性，建立了以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢查方法(T-SPOT)結(jié)核病診斷技術(shù)。它已初步證實(shí)對結(jié)核感染診斷具有高度敏感性和特異性，而且具有快速(24～48 h)、不受卡介苗(BCG)接種和其他分枝桿菌影響的優(yōu)點(diǎn)[1-4]。我們以結(jié)核γ干擾素釋放試驗(yàn)(TB-IGRA)檢測以確診為結(jié)核病的657例患者，并以205例非結(jié)核患者為對照，探討γ干擾素釋放試驗(yàn)對結(jié)核病的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為我院2012年2月至2012年12月在我院住院治療的患者，共862例，確診為結(jié)核患者657例，非結(jié)核患者205例。結(jié)核的確診符合2008年國家衛(wèi)生部頒發(fā)的《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》。657例確診結(jié)核患者發(fā)病至確診時(shí)間平均2～8周，平均3.89周；病種為，肺結(jié)核521例(原發(fā)性結(jié)核167例，血行播散型結(jié)核119例，繼發(fā)性結(jié)核182例，結(jié)核性胸膜炎53例)，肺外結(jié)核136例(腸結(jié)核32例，淋巴結(jié)結(jié)核43例，骨結(jié)核例21，結(jié)核性腹膜炎例16例，結(jié)核性腦膜炎23例，腎結(jié)核1例)；患者男421例，女236例；年齡16～78歲，平均(41±12)歲。205例非結(jié)核患者發(fā)病至確診時(shí)間平均為2～5周，平均3.04周；病種為，肺癌141例，肺膿腫2例，病毒性腦膜腦炎59例，骨腫瘤3例；患者男165例，女40例；年齡18～83歲，平均(46±16)歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：主要試劑為上海復(fù)興T-SPOT．TB試劑。主要儀器為湘儀離心機(jī)TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)，eppendorf Centrifuge 5804 R離心機(jī)，Thwrrno SCIWNTIFIC CTHERMO FISHER(二氧化碳培養(yǎng)箱)北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司，倒置37XC顯微鏡(上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司)。德國AID read酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀。所有檢測均在本院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

1.2.2 γ干擾素釋放釋放試驗(yàn)：患者入院第2天用檸檬酸鈉抗凝的真管采血外周靜脈血8 ml，充分混勻，分離單個(gè)核細(xì)胞。選擇AIM培養(yǎng)液將其調(diào)至250萬單個(gè)核細(xì)胞，加入至試劑盒內(nèi)。每例標(biāo)本4個(gè)微孔板，加入混合抗原A和混合抗原B、陽性對照與AIM， CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜孵育后，洗脫pbs，加入抗γ干擾素， 4攝氏度下孵育2 h，洗脫P(yáng)BS，去離子水充分洗滌孔的內(nèi)部終止反應(yīng)。待顯色后曬干。用酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀檢測微孔中的有色斑點(diǎn)數(shù)量。

1.2.3 結(jié)果判斷：對照斑點(diǎn)數(shù)<6為陰性，混合抗原A或B減去對照斑點(diǎn)數(shù)≥6為陽性。陰性對照數(shù)≥6、孔斑點(diǎn)數(shù)大于2倍的陰性對照數(shù)，則為陽性。按照公式手工計(jì)算敏感度、特異度、假陽性率、假陰性率、準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 862例住院患者，出院時(shí)確診為結(jié)核患者者657例，非結(jié)核患者205例。657例確診結(jié)核患者中，肺結(jié)核521例，肺外結(jié)核136例(腸結(jié)核32例，淋巴結(jié)結(jié)核43例，骨結(jié)核例21，結(jié)核性腹膜炎例16例，結(jié)核性腦膜炎23例，腎結(jié)核1例)。205例非結(jié)核患者中，肺癌141例，肺膿腫2例，病毒性腦膜腦炎59例，骨腫瘤3例。

2.2 診斷性試驗(yàn)評價(jià)結(jié)果 以患者在院內(nèi)確診為金標(biāo)準(zhǔn)，TB-IGRA敏感度為0.849，特異度為0.585，假陽性率為0.415，假陰性率為0.151，準(zhǔn)確率為0.787。見表1。

表1 862例患者結(jié)核診斷性試驗(yàn)評價(jià)結(jié)果 例

注：敏感度=a/(a+c)=558/(558+99)=0.849;特異度=d/(b+d)=120/(85+120)=0.585;假陽性率=b/(b+d)=85/(85+120)=0.415;假陰性率=c/(a+c)=99/(558+99)=0.151;準(zhǔn)確率= (a+d)/(a+b+c+d)=678/862=0.787

3 討論

本研究檢測了657例結(jié)核確診患者及205例非結(jié)核患者，結(jié)果顯示，結(jié)核確診病例中γ干擾素釋放陽性率為84.9%，陰性率為15.1%。TB-IGRA診斷結(jié)核的靈敏度為0.849，特異度為0.585，說明本方法在診斷結(jié)核方面有較好的靈敏度和特異度，該方法可以用于結(jié)核的診斷。與其他報(bào)的的研究相比，在敏感度方面與其他的報(bào)道的靈敏度(0.83-0.95)相當(dāng)，在特異度方面，較其他報(bào)道的特異度(0.58～0.93)較低[1-3,5，6]。本研究的樣本量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于高孟秋等[5，6]研究的樣本量，所以可信度比較高。但是本研究中，對結(jié)核的診斷未按照病種進(jìn)行研究，同時(shí)未考慮到抗結(jié)核治療對結(jié)果的影響，在繼發(fā)性結(jié)核中亦未考慮到原發(fā)病對檢測結(jié)果的影響。

TB-IGRA已被歐盟、加拿大、美國審批用與結(jié)核病的診斷[7]。其原理是結(jié)核分枝桿菌特異的抗原ESAT-6和CFP-10刺激肝素鈉抗凝的全血，再通過ELISA定量或定性檢測其上清液中分泌的γ干擾素，以此判定人體是否有致病結(jié)核分枝桿菌的感染。IGRA包括基于全血培養(yǎng)的酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ，ELISA)和基于外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)，是近十年來分枝桿菌基因組學(xué)及其細(xì)胞免疫研究成果在結(jié)核病診斷領(lǐng)域的成功應(yīng)用。ELISpot從單細(xì)胞水平檢測分泌干擾素(IFN)-γ的結(jié)核特異性T細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法，據(jù)此判斷是否存在結(jié)核感染。該方法源于Mahairas等在1996年發(fā)現(xiàn)的一段存在結(jié)核分枝桿菌中名為RD1的基因序列，而在卡介苗菌株和大部分環(huán)境中的分枝桿菌基因中則缺乏RD1序列。ESAT-6(early secreted antigenic target 62kDa protein)和CFP-10(culture filtrate protein 10)是RD1編碼的2種蛋白，因此僅存在于結(jié)核分枝桿菌中，可以認(rèn)為是結(jié)核特異性的蛋白。T-SPOT.TB即以ESAT-6和CFP-10作為結(jié)核特異性抗原刺激機(jī)體特異性T細(xì)胞[8，9]。由于IGRA使用的兩種特異性抗原ESAT6和CFP10具有很強(qiáng)的Th1 細(xì)胞免疫原性，且在所有制備卡介苗的菌株和環(huán)境中的絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中都不存在，因而不受卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌感染的影響，在結(jié)核分枝桿菌感染(包括活動性結(jié)核和結(jié)核潛伏感染)中的診斷價(jià)值較高，而且具有快速、高靈敏度和特異度、不受機(jī)體免疫狀態(tài)(如AIDS患者)影響的優(yōu)點(diǎn)[10-12]。

在以后的研究中，我們還將進(jìn)一步研究TB-IGRA試驗(yàn)在肺結(jié)核、肺外結(jié)核、不同免疫狀態(tài)的患者中是否有差別，為提高結(jié)核病診斷技術(shù)提供依據(jù)支持。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.009

項(xiàng)目來源：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：30873465)

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張金花，100094 中國人民解放軍309醫(yī)院干部病房；

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R 52

A

1002-7386(2014)13-1948-02

2014-01-11)