室溫測定凝血酶原時間及國際標準化比率方法學研究

劉素平

·臨床研究·

室溫測定凝血酶原時間及國際標準化比率方法學研究

劉素平

凝血酶原時間；標準化

凝血酶原時間(PT)是臨床常用的測定外源性凝血因子的過篩實驗，具有敏感、快速的優點，廣泛用于多種疾病的診斷和治療[1]，PT檢測方法主要包括Owren法與Quick法兩種。我國多數實驗室采用Quick法檢測PT。目前，Quick法檢測PT一般采用濕化學法，即將液體凝血活酶及CaCl2與標本混合，37℃條件下記錄凝固時間。這需要恒溫裝置將反應體系溫度穩定在37℃，而且儀器開機后需要一定的預溫時間才能進行標本的檢測。該方法與干化學法相比未不夠簡便、快速，不能滿足床旁檢驗的需求。為了使各種不同的凝血活酶試劑測定相同標本得出的PT結果具有可比性，國際血栓與止血委員會(ICTH)與國際血液學標準化委員會(ICSH)推薦將國際標準化比率(international normalized ratio，INR)作為PT的報告方式[2，3]。本研究旨在建立室溫下檢測INR的濕化學方法，為濕化學法INR床旁檢驗方法的建立提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2006年10月至2007年4月河北醫科大學第二醫院住院及門診患者44例，分為正常對照組及華法林抗凝治療組2組，正常對照組包括正常體檢者20例，其中男13例，女7例；年齡(46±16)歲。華法林抗凝治療組包括口服華法林抗凝治療兩周以上患者22例，其中男12例，女10例；年齡(42±9)歲。

1.2 儀器與試劑 美國Pacific Hemostasis公司生產凝血質控品(level1，lever2)；美國Instrument Laboratory 公司生產凝血酶原時間檢測試劑；美國Instrument Laboratory 公司生產ACL9000全自動凝血分析儀。

1.3 方法 抽取正常體檢者及華法林抗凝治療患者靜脈血2.7 ml，109 mmol/L枸掾酸鈉1∶9抗凝，3000 r/min離心15 min，分離血漿，-20℃保存備用。按《全國臨床檢驗操作規程(第3版)》推薦方法分別測定兩質控品在18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃、39℃、41℃條件下凝血酶原時間。根據兩質控品耙值(INRlevel 1∶1.03，INRlevel 2∶1.89)及不同溫度下兩質控品PT值，由下式計算出不通溫度下正常對照凝血時間(NCT)及試劑ISI值。以溫度(t)為自變量，分別以NCT、ISI為因變量，采用曲線估計方法建立回歸方程。室溫(24.5℃)條件下按《全國臨床檢驗操作規程(第3版)》推薦方法分別測定正常對照組及華法林抗凝治療組凝血酶原時間，根據3.3得到的回歸方程計算出INR值,以溫度(t)為自變量，NCT為因變量，采用曲線估計方法建立回歸方程如下。NCT=71.4462-3.2239t+0.447t2。以溫度(t)為自變量，ISI為因變量，采用曲線估計方法建立回歸方程如下。ISI=2.164+0.0033t-0.0007t2。ACL9000全自動凝血分析儀檢測37℃條件下正常對照組及華法林抗凝治療組INR值，采用配對t檢驗方法比較兩種方法得到INR值的差別。采用Pearson相關分析法計算兩種方法得到INR值的相關性。

2 結果

2.1 不同溫度下測定兩質控品PT及計算得到NCT、ISI值 見表1。

表1 不同溫度下測定兩質控品PT及NCT、ISI值

2.2 2組室溫(24.5℃)及37℃條件下INR值 室溫(24.5℃)及37℃條件下測定正常對照組及華法林抗凝治療組INR值結果差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2室溫(24.5℃)及37℃條件下正常對照組及
華法林抗凝治療組INR值

組別PT室溫(s)PT37℃(s)INR室溫INR37℃正常對照組(n=20)22.79±2.0113.29±1.201.06±0.141.09±0.14抗凝治療組(n=22)34.16±8.7619.87±5.111.91±0.701.93±0.69

3 討論

1910年Duke首先使用出血時間(BT)檢測機體凝血功能，開創了凝血檢測的先河。Quick、Proctor和Rapaport分別于1930年和1960年報道了經典的外源和內源性凝血系統的過篩試驗PT和活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time ，APTT)。1950年Schnitger和Cross率先推出四通道自動凝血分析儀,該儀器采用凝固法分析原理,通過檢測血漿標本在凝固過程中電流的變化來判斷凝固點[4]。20世紀70年代,隨著臨床化學、生物技術、免疫學技術的飛速發展，自動凝血分析技術發展迅速。目前,自動凝血分析儀已發展到第3代產品[5]。其的特點是自動化程度高,可快速定量分析止血與血栓系統的多種成分,已接近全自動臨床化學分析儀的水平,如MDA-180凝血分析儀(1991年)及隨后的CA6000凝血分析儀等。自動凝血儀發展的另一趨勢是床旁凝血儀的不斷出現,尤其適應于床床旁監測[6]。

凝血酶原時間(PT)是當前監測口服抗凝藥物效果的主要試驗指標，長期以來，PT得報告方式多種多樣。如報告時間(秒)、百分活度、比率和PT指數等。由于PT檢測結果受試劑來源不同、檢測儀器和操作技術等多種因素影響，其結果可能差異較大[7]，為解決此問題，WHO于1979至1983年提出用參比凝血活酶校正市售凝血活酶，計算得到國際標準化比率(INR)作為標準化PT的報告方式，其公式為：其中NCT為正常對照均值PT。ISI為國際敏感指數，ISI是凝血活酶試劑與國際參比凝血活酶比較的敏感度。INR作為標準化報告方式在口服抗凝藥物的治療監測方面取得了巨大的進展，大大提高了長期用藥的安全性[8]，目前INR系統在我國已經被廣泛接受。

目前，床旁凝血儀已開始在臨床應用，INR的床旁分析具有快速、簡便、結果穩定、重復性好的優點,能提供較準確的過篩數據,而且大大節約了完成試驗所需的時間,尤其適應于抗凝和溶栓治療的床旁監測[9]。現在床旁凝血儀主要利用干化學技術進行PT及INR的檢測。其原理是用惰性順磁鐵氧化顆粒(PIOP)結合于可產生纖溶或凝固反應的干試劑中。PIOP可在固定垂直磁場作用下移動。當血標本通過毛細管作用進入反應層后,將干試劑溶解,并發生相應的纖溶或凝固反應,與試劑結合的PIOP在反應過程中其移動或擺動幅度的大小發生改變，從而提供纖維蛋白溶解或形成的動力學特征。光電檢測器可記錄PIOP擺動所產生的光度變化。信號經放大、轉換、計算而得到PT及INR檢測結果[10]。該方法由于檢測成本遠遠高于濕化學法，因而在臨床應用上受到一定限制。目前尚無利用濕化學法進行PT/INR床旁檢驗的儀器。本研究表明，利用溫度(t)于NCT及ISI的回歸方程可計算出室溫條件下(18～41℃)任意溫度的INR值。通過該方法室溫下測定正常人INR值與37℃條件下INR測定值無顯著性差異，且具有很好的相關性(P=0.999)。對于華法林抗凝治療患者，室溫下INR值與37℃條件下INR測定值也具有很好的相關性，表明該方法同樣適用于華法林抗凝效果監測。

隨著電子計算機技術及生物技術的飛速發展，凝血檢測正向著兩個方向發展，一是高度自動化、智能化的全自動凝血分析，一類是微量、快速、簡便的床旁凝血分析。但由于干化學法床旁凝血分析儀受本身檢測原理的限制，檢測成本較高，未能在各級醫療單位普及使用。本研究結果表明室溫下利用濕化學法檢測PT/INR具有與全自動凝血分析儀一致的結果，是檢測外源性凝血系統異常及華法林抗凝效果檢測的一種可靠方法，為濕化學法PT/INR床旁檢測提供了理論及試驗基礎。

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4 Hein SM,Reinauer H.Automationincoagulationtesting.JIFCC,1996,8:117.

5 Mohammed A,Mehrabani PA,Coombs R,et al.The MDA-18 coagulation analyzer:alaboratoryevaluation Pathology，1997,29:176.

6 程貴法.凝血分析儀的原理發展及結果影響分析.醫學影像與檢驗，2011,24：317-318.

7 李芒會，李亞娥.不同分析原理的凝血儀檢測PT和INR值的研究.現代檢驗醫學雜志，2012,27：73-75.

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9 韓俊麗，田紅燕，吉亞紅，等.便攜式血凝儀在抗凝治療監測中的應用.臨床和實驗醫學雜志，2012,11：1779-1782.

10 田寧，黃山，張健.自動凝血分析方法與技術的進展.安徽醫藥，2001，5:288-289.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.044

065000 河北省廊坊市中醫院

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1002-7386(2014)13-2023-02

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