脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用及其機(jī)制研究

楊宇 張宇平 董航 吳宇 王賀

·實(shí)驗(yàn)研究·

脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用及其機(jī)制研究

楊宇 張宇平 董航 吳宇 王賀

目的 研究脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用及作用機(jī)制。方法 16只大鼠作為研究對(duì)象, 利用完全弗氏佐劑構(gòu)建大鼠慢性炎癥痛模型, 對(duì)其行電針操作, 并于鞘內(nèi)注射適量的脊髓孤啡肽及其受體拮抗劑, 觀察脊髓孤啡肽在針刺操作中對(duì)大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果 注射15 nmol脊髓孤啡肽的D組大鼠縮爪潛伏期水平明顯高于注射生理鹽水A組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而注射15 nmol的B組與注射5 nmol的C組與A組比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相比單純針刺治療組、單純脊髓孤啡肽組, 脊髓孤啡肽+針刺組大鼠縮爪潛伏期水平明顯更高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 脊髓孤啡肽主要是通過抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子, 參與痛覺調(diào)制達(dá)到鎮(zhèn)痛的作用。

炎癥痛；針刺鎮(zhèn)痛；孤啡肽；作用；機(jī)制

炎癥痛在臨床上比較常見, 其發(fā)病機(jī)制尚不明確, 但細(xì)菌感染、病毒感染、創(chuàng)傷及外科手術(shù)等諸多因素可能引發(fā)外周組織損傷, 進(jìn)而出現(xiàn)持續(xù)疼痛癥狀, 主要表現(xiàn)為痛覺過敏、自發(fā)疼痛等［1］。孤啡肽屬于阿片受體的內(nèi)源性配體, 相關(guān)研究表明孤啡肽及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在, 參與痛覺調(diào)節(jié)等系列生理活動(dòng)［2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明脊髓孤啡肽可以對(duì)神經(jīng)痛大鼠發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究就此主要研究脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用及作用機(jī)制, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇16只大鼠作為研究對(duì)象, 其中雄性大鼠12只, 體重85~287 g, 平均體重(186.7±20.9)g, 雌性大鼠4只, 體重56~250 g, 平均體重(136.8±18.7)g。16只大鼠飼養(yǎng)在12 h光照、12 h黑暗的環(huán)境中, 嚴(yán)格按照國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)操作。主要藥物及試劑：核糖核酸酶抑制劑、瓊脂糖、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA、胰蛋白酶等。儀器設(shè)備：超聲破碎機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、顯微鏡、離心機(jī)、恒冷切片機(jī)、電針儀、輻射熱測痛儀、電熱干烤箱、過濾器等。1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建大鼠炎癥痛模型 用戊巴比妥鈉(計(jì)量為40 mg/kg)麻醉大鼠后, 把100 μl完全弗氏佐劑注射到大鼠左后肢, 構(gòu)建慢性炎癥痛模型。用輻射熱測痛儀測定大鼠縮爪潛伏期情況, 具體操作：保持室溫在18~22℃, 隨后把大鼠放置到輻射熱測痛儀玻璃中, 不限制大鼠活動(dòng)。在大鼠靜置20 min后開始測定, 每隔10 min測量1次, 測量3次后取均值。在這個(gè)過程中, 把縮爪潛伏期上限值設(shè)置為20 s, 保護(hù)大鼠不被燙傷。

1.2.2 電針操作 保持室溫18~22℃, 于木架上固定大鼠軀干, 不限制大鼠頭部、四肢的活動(dòng)范圍, 靜置20 min后開始針刺治療, 穿刺穴位為大鼠的環(huán)跳穴、陽陵泉穴, 合理設(shè)置電針治療儀相關(guān)參數(shù), 疏波頻率為4 Hz, 串長2.5 s, 密波頻率為60 Hz, 串長5 s。治療以大鼠后肢肌肉輕度抖動(dòng)為主, 治療時(shí)間為0.5 h左右。另外進(jìn)行“假電針”操作, 操作步驟與電針治療一致, 唯一不同的是假電針不通電。

1.2.3 鞘內(nèi)注射 麻醉大鼠后從上棘L3~4腰椎間隙處把PE-10聚乙烯管插入, 進(jìn)管深度為3.5 cm, 溢出腦脊液后封鎖外口, 縫合皮膚后將導(dǎo)管固定在皮膚上。同時(shí)每天注射10萬U的青霉素G鉀, 避免感染。不同的大鼠注射不同濃度的脊髓孤啡肽, 用10 μl的生理鹽水進(jìn)行稀釋, 經(jīng)由插入的PE-10聚乙烯管把脊髓孤啡肽注入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔中, 注射時(shí)間為1 min, 嚴(yán)格控制注射速度。

1.2.4 相關(guān)物質(zhì)檢測 按照組織切片相關(guān)要求及標(biāo)準(zhǔn)完成大鼠組織切片制作, 然后利用免疫組織化學(xué)法檢測切片中的染色信號(hào)等指標(biāo)。抽取大鼠血液標(biāo)本, 常規(guī)離心出血清, 提取出組織總蛋白, 并用Bradford方法測量蛋白質(zhì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓孤啡肽對(duì)大鼠炎癥痛的影響 大鼠炎癥痛建模后把大鼠分為四組, 各4只, A組注射生理鹽水, B組注射1.5 nmol脊髓孤啡肽, C組為5 nmol脊髓孤啡肽, D組為15 nmol脊髓孤啡肽, 給藥前1.5 h、1 h、0.5 h、10 min觀察大鼠縮爪潛伏期變化, D組大鼠縮爪潛伏期水平明顯高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而B組、C組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 不同劑量脊髓孤啡肽不同時(shí)間段縮爪潛伏期變化情況

2.2 脊髓孤啡肽對(duì)大鼠針刺鎮(zhèn)痛的影響 大鼠炎癥痛建模后把大鼠分為四組, 各4只, A組注射生理鹽水, B組采取電針治療, C組為脊髓孤啡肽(15 nmol), D組為脊髓孤啡肽(15 nmol)+電針治療, 給藥前1.5 h、1 h、0.5 h、10 min觀察大鼠縮爪潛伏期變化, 與A組比較, B組、C組及D組大鼠縮爪潛伏期水平明顯增多, 其中D組大鼠縮爪潛伏期水平明顯高于B組、C組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前臨床上治療慢性炎癥痛的方法很多, 如抗炎藥物、鎮(zhèn)痛藥物等, 長時(shí)間服用會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用。針刺屬于中醫(yī)療法, 安全有效, 可用于慢性炎癥痛鎮(zhèn)痛治療。相關(guān)動(dòng)物模型試驗(yàn)表明脊髓孤啡肽參與痛覺調(diào)制, 且不同水平的脊髓孤啡肽的鎮(zhèn)痛作用不一。很多不同動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明脊髓孤啡肽具有較高的鎮(zhèn)痛作用, 且從鞘內(nèi)注射脊髓孤啡肽能明顯增強(qiáng)阿片肽的鎮(zhèn)痛功效［3］。

3.1 脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用 解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)脊髓孤啡肽及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布, 特別是和痛覺關(guān)系甚密的區(qū)域, 如脊髓背角等, 這表明內(nèi)源性的脊髓孤啡肽-阿片受體樣受體系統(tǒng)可能參與痛覺調(diào)制。本研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠脊髓背角中也存在脊髓孤啡肽及其受體。另外在慢性炎癥痛病程發(fā)展過程中脊髓背角的脊髓前孤啡肽原信使RNA表達(dá)不斷上升, 而孤啡肽免疫陽性細(xì)胞含量卻下降, 這與炎癥痛發(fā)展過程中孤啡肽釋放量大于其合成速度有關(guān)。同時(shí)阿片受體樣受體信使RNA表達(dá)隨之上升,表明脊髓孤啡肽-阿片受體樣受體系統(tǒng)在炎癥痛發(fā)展過程中被激活, 且參與到炎癥痛調(diào)制中。

3.2 脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用機(jī)制分析 疼痛、知覺等都是由神經(jīng)元介導(dǎo)的, 特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng), 該系統(tǒng)中含有的膠質(zhì)細(xì)胞能為射精元提供營養(yǎng)支持, 且膠質(zhì)細(xì)胞沒有劃分樹突、突起無軸突, 進(jìn)而沒有其他細(xì)胞擁有的信號(hào)傳遞功能, 當(dāng)痛覺導(dǎo)入信號(hào)時(shí)僅會(huì)讓脊髓神經(jīng)元的興奮性產(chǎn)生變化, 可見脊髓層面上的疼痛調(diào)節(jié)與脊髓膠質(zhì)細(xì)胞沒有關(guān)系, 而與脊髓神經(jīng)元及其遞質(zhì)密切相關(guān)。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)元功能受脊髓膠質(zhì)細(xì)胞影響, 在一定程度上參與到痛覺過敏及持續(xù)疼痛中。而脊髓膠質(zhì)細(xì)胞與炎癥、外周組織損傷等相關(guān)因素有關(guān), 一旦脊髓膠質(zhì)細(xì)胞被激活,則會(huì)釋放很多與痛覺相關(guān)的致痛物質(zhì), 如白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等。這些炎癥因子雖然與生理性痛無關(guān), 但在病理性痛中有著不可或缺的作用。

［1］ 葛志軍.脊髓水平NMDA受體NR1亞單位磷酸化在孤啡肽痛覺調(diào)控中的作用研究.中國醫(yī)科大學(xué), 2009.

［2］ 王薇鈞, 盧峻, 黃怡然, 等.電針對(duì)慢性炎癥疼痛大鼠下丘腦ENK與脊髓OFQ含量的影響.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010(3): 196-199.

［3］ 崔曉魯.側(cè)腦室注射抗生長抑素血清在炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用機(jī)制.山東中醫(yī)藥大學(xué), 2011.

2014-06-26］

110034 沈陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室(楊宇)；沈陽醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系(張宇平 董航 吳宇 王賀)