RP-HPLC法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質

趙亮 徐炳欣 石曉曉 蘭丙欣

RP-HPLC法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質

趙亮 徐炳欣 石曉曉 蘭丙欣

目的 建立高效液相色譜法測定紫杉醇注射液的含量及有關物質的方法。方法 應用HPLC法, 色譜柱為Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 檢測波長為227 nm, 柱溫35℃, 流速為1.0 ml/min, 進樣量為20 μl, 流動相為甲醇-乙腈-水(45:30:25, v/v)。結果 紫杉醇濃度在10~125 mg·L-1的范圍內, 溶液的濃度與色譜峰面積線性關系良好(R2=0.9998, n=6)。精密度試驗RSD為0.17%(n=5), 平均加樣回收率為99.33%, RSD=0.38%。結論 本方法簡便、準確、快速、重復性好, 可用于紫杉醇注射液的含量測定和有關物質檢查。

紫杉醇注射液；高效液相色譜法；含量測定；有關物質

紫杉醇(paclitaxel)是從短葉紫杉樹皮中提取的具有抗癌活性物質, 為一種新型的抗微管藥物［1］。紫杉醇的作用機制為：促進微管雙聚體裝配成微管, 并通過干擾去多聚化過程而使微管的穩定, 從而抑制微管網正常動力學重組, 導致細胞分裂受阻。此外, 本藥還具有放射增敏效應, 可促進離子照射所致細胞損害［2,3］。臨床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等癌癥的治療［4,5］。藥物含量是評價藥品質量的重要指標之一, 為保證紫杉醇注射液的質量, 實現臨床用藥安全可靠, 作者嘗試建立高效液相色譜法(HPLC)測定其含量。該方法準確, 重復性好, 專屬性強, 與中國藥典2010年版收錄的紫杉醇含量測定方法相比較, 具有簡便、快速的優點。

1 儀器與試藥

島津LC-15C高效液相色譜儀；島津SPD-15C Essentia uv/vis檢測器；島津工作站LC-solution；AR 1140 型電子天平(梅特勒·托利多儀器有限公司)；KQ3200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AUW 120D 型電子天平(日本島津公司)。

紫杉醇對照品(許昌恒生藥業有限公司提供, 純度>99.9%, 批號為A0177)；紫杉醇注射液(購于江蘇紅豆衫藥業有限公司, 規格5 ml/30 mg, 批號分別為20130801, 20130805, 20130809)；甲醇(色譜純)(天津市四友精細化學品有限公司)；乙腈(色譜純)(天津市四友精細化學品有限公司)；其它試劑均為分析純, 水為超純水。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 檢測波長227 nm, 柱溫35℃, 流速為1.0 ml/min, 進樣量為20 μl, 流動相為甲醇-乙腈-水(45:30:25, v/v)。

2. 2 對照品溶液的配制 精密稱取紫杉醇對照品適量, 置于10 ml容量瓶中, 加乙醇稀釋并定容至刻度, 搖勻, 得濃度為500 mg·L-1對照品貯備液。

2. 3 樣品溶液的制備 分別取批號為20130801, 20130805, 20130809的3批紫杉醇注射液適量, (相當于紫杉醇6 mg)置于100 ml容量瓶中, 加乙醇稀釋并定容至刻度, 搖勻即得。

2. 4 專屬性試驗 紫杉醇對照品(A)和樣品中紫杉醇的HPLC圖(B), 見圖1。

圖1 對照品(A)及樣品(B)

2. 5 線性關系考察 精密量取“2.2”項下對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml, 分別置于10 ml容量瓶中, 用乙醇稀釋并定容至刻度, 搖勻, 得到對照品濃度分別為10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；進樣, 記錄峰面積值。以對照品濃度(X)為橫坐標, 對照品峰面積(Y)為縱坐標, 進行線性回歸, 得回歸方程：Y=40555X-34526, R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10~125 mg·L-1時線性關系良好。

2. 6 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液, 按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次, 其峰面積的RSD為0.17%(n=5)。2. 7 穩定性試驗 取“2.3”項下樣品溶液(批號：20130805)在室溫避光下放置, 分別于0、2、4、6、8、12 h時, 在儀器不關閉狀態下測定不同時間內的含量。結果, 樣品含量的RSD為0.26%(n=6), 表明樣品溶液在12 h內穩定性好。

2. 8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量批號為20130805的紫杉醇注射液適量(相當于紫杉醇3 mg), 分別精密加入紫杉醇對照品適量, 置于100 ml容量瓶中, 用乙醇稀釋并定容至刻度, 搖勻, 按“2.1”項下實驗條件進樣, 結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2. 9 樣品含量測定 將3批樣品溶液分別按“2.1”項下實驗條件進樣, 結果見表2。

2. 10 有關物質檢查 采用不加校正因子的主成分自身對照法。精密稱取紫杉醇適量, 置10 ml 容量瓶中, 加乙醇稀釋并定容至刻度, 搖勻, 制成200 mg·L-1的溶液作為供試品溶液；取供試品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中, 加流動相稀釋至刻度, 作為對照溶液。取對照溶液20 μl進樣, 調節檢測靈敏度, 使主峰高達到記錄儀滿量程的10%左右, 再取供試品溶液進樣20 μl, 記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。扣除溶劑峰和輔料峰, 量取色譜圖上紫杉醇色譜峰外各雜質的峰面積總和, 并與對照溶液主成分的峰面積比較, 計算雜質含量。結果見表2, 3批樣品中有關物質均<1.2%。

表2 含量及有關物質測定結果

3 討論

應用紫外分光光度計對紫杉醇在190~400 nm范圍內掃描, 結果顯示紫杉醇在227 nm處有較強吸收。作者采用227 nm作為該分析方法的檢測波長, 可獲得較高靈敏度, 基線平穩, 良好的峰形。

為了得到一個良好的分析效果, 作者在試驗中對流動相進行了優化。試驗分別考察了甲醇-水系統、乙腈-水系統、甲醇-乙腈-水系統, 結果發現以甲醇-乙腈-水系統為流動相, 在選定的檢測波長條件下, 基線穩定, 能夠得到良好的峰形, 最終確定流動相為甲醇-乙腈-水(45:30:25, v/v)為該分析方法的流動相。總之, 本方法操作簡便、準確度高、重現性好, 可用于紫杉醇含量的測定與質量控制。

［1］ Jared Bushman, Asa Vaughan, Larisa Sheihet, et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release, 2013,171(3):315-321.

［2］ 趙惠.紫杉醇周圍神經毒性臨床觀察.中國實用醫藥, 2008, 3(13):136-137.

［3］ 龔奎玉,王志東,李建璜.中國實用醫藥, 2008,3(21):73-75.

［4］ Michela Di Michelea, Simone Marconea, Lucia Cicchillitti, et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines: Towards the identification of putative biomarkers. Journal of Proteomics, 2010,73(5):879-898.

［5］ Rong Liua, Denis M. Gilmorea, Kimberly Ann V. Zubris, et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic. Biomaterials, 2013,34(7):1810-1819.

Determination of paclitaxel injection and its related substances by HPLC

ZHAO Liang, XU Bing-xin, SHI Xiao-xiao,
et al. Xuchang Central Hospital, Xuchang 461000, China

Objective To establish a method for the determination of paclitaxel injection and its related substances by High Performance Liquid Chromatography(HPLC). Methods The determination was performed on the following conditions: the colum was Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), the mobile phase was methanol-acetonitrile-water (45:30:25, v/v), the detected wavelength was 227 nm, the colum temperature was 35℃, the flow rate was 1.0 ml/min, the injection volume was 20 μl. Results The linear concentration range was from 10 to 125 mg·L-1of paclitaxel(R2=0.9998, n=6). The RSD of precision test was 0.17%. The average recovery was99.33 %, RSD=0.38%. Conclusion The method is simple, accurate, rapid and reproducible. It can be used to detect the content of paclitaxel injection and its related substances.

Paclitaxel injection; HPLC; Determination; Related substances

461000 許昌市中心醫院(趙亮 徐炳欣 蘭丙欣)；許昌市建安醫院(石曉曉)

徐炳欣 E-mail：xin4891@126.com