258例血清中抗-HCV陽性聯合HCV-RNA定量檢測結果分析

龐麗娜 薛金方

258例血清中抗-HCV陽性聯合HCV-RNA定量檢測結果分析

龐麗娜 薛金方

目的 探討丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)和丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)定量聯合檢測結果對丙型肝炎確診的臨床意義。方法 對258例ELISA法檢測的血清抗-HCV陽性丙型肝炎(HC)患者, 同時采用PCR-熒光探針法檢測其HCV-RNA含量。結果 258例抗-HCV陽性丙型肝炎患者中HCV-RNA陰性92例, 占35.66%；17例HCV-RNA弱陽性, 占6.59%；HCV-RNA陽性149例,即57.75%的HC患者存在病毒血癥。結論 ELISA法聯合檢測抗-HCV和HCV-RNA有助于丙型肝炎確診病毒血癥以及監控HCV的感染, 并及時進行抗病毒治療。

丙型肝炎病毒抗體; 丙型肝炎病毒核糖核酸; 丙型肝炎; PCR-熒光探針

丙型病毒性肝炎是一種臨床多發疾病, 其一般癥狀較輕,但病情呈進行性進展, 如果治療不及時易形成肝硬化甚至是肝癌［1］, 因此準確及時地對丙型肝炎患者進行早期確診和療效觀察顯得十分重要。丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)及丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)是診斷丙型肝炎(HC)的主要病原學指標［2,3］, 前者是間接反映HCV的感染與既往感染,后者是反映患者血清中是否存在病毒血癥。本文對258例丙型肝炎病毒抗體陽性的丙型肝炎患者進行丙型肝炎病毒核糖核酸檢測, 旨在探討丙型肝炎確診病毒血癥以及監控HCV的感染, 并及時進行抗病毒治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年5月~2014年5月本院門診及住院的臨床確診丙型肝炎患者258例, 其中男139例, 女119例。年齡19~82歲, 平均年齡45歲。

1.2 儀器與試劑 用于檢測HCV-RNA的熒光定量PCR試劑盒購于中山大學達安基因股份有限公司, 儀器為中山大學達安基因股份有限公司ABI Prism 7500 Real Time PCR System,抗-HCV ELISA診斷試劑盒購自麗珠生物工程公司。

1.3 HCV-RNA熒光定量測定

1.3.1 標本處理以及RNA提取 取50 μl經高壓滅菌處理的離心管, 加200 μl裂解液, 再分別加入200 μl血清, 漩渦振蕩15 s混勻后高速離心10 s, 然后72℃放置10 min；再加入250 μl無水乙醇, 蓋緊管蓋, 振蕩15 s后移至離心柱室溫下12 000 rpm離心1 min, 將離心柱裝至新的收集管；再加入500 μl的抑制物去除液, 室溫下12 000 rpm離心1 min, 將離心柱裝至新的收集管；再加入500 μl的去離子液, 室溫下12 000 rpm離心1 min, 將離心柱裝至新的收集管；再次加入500 μl的去離子液, 室溫下12 000 rpm離心1 min, 將離心柱裝至新的收集管；將離心柱-收集管于室溫下14 000 rpm離心3 min以除去殘余的乙醇；將離心柱取出, 放置于新的1.5 ml離心管, 打開離心柱蓋子, 72℃放置2 min；在離心柱的膜的正上方小心加入72℃預熱的洗脫液35 μl, 蓋緊離心柱管蓋,室溫靜置1 min后, 14 000 rpm離心1 min。

1.3.2 PCR擴增 將反應管放入儀器樣品槽內, 儀器循環條件設置為50℃ 15 min, 1個循環；95℃ 15 min, 1個循環；94℃ 15 s→55℃ 45 s(收集熒光), 45個循環。每批PCR試驗均做陰性、陽性和臨界陽性對照。

1.3.3 結果判定 反應結束后自動保存結果, 根據分析后圖像調節Baseline的Start值、End值以及Threshold值, 點擊Analysis自動獲得分析結果, 在Report界面察看結果。若樣本的C<1.00E+003, 則該樣品的HCV-RNA 濃度<1×103IU/ml； 若樣本的1.00E+003≤C≤1.00E+007, 則該樣品的HCV-RNA 濃度1×103IU/ml≤C≤1×107IU/ml； 若樣本的C>1.00E+007,則該樣品的HCV-RNA 濃度>1×107IU/ml；報告相應的病毒載量。

1.4 抗-HCV檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA), 抗-HCV ELISA試劑盒的包被抗原為合成多肽抗原和基因工程抗原(包括HCV病毒結構區核心抗原和非結構區抗原), 操作嚴格遵從試劑盒說明書及免疫學要求進行, 測得的標本的OD≥COV為陽性, 小于閾值為陰性(閾值=0.05+0.08×陽性對照臨界平均值)。

2 結果

258例抗-HCV陽性樣本中, HCV-RNA陰性92例；HCV-RNA在臨界值范圍內的有17例；HCV-RNA陽性有149例。具體見表1。

表1 258例ELISA抗-HCV陽性和HCV-RNA 檢測結果(n, %)

3 討論

丙型肝炎, 是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引起的一種傳染病。丙型肝炎呈世界性分布, 我國一般人群HCV的感染率為3.2%［4］。我國丙型肝炎感染率僅次于乙型肝炎。據報道世界范圍內27%的肝硬化和25%的原發性肝細胞癌發生于HCV感染者［5］, 由于尚無有效的預防和治療方法, 丙型肝炎病毒感染者中絕大部分發展成慢性感染,進而發生肝硬化和肝細胞性肝癌［1］。丙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的病毒性肝炎, 由于起病隱匿, 大多數感染者無明顯的臨床癥狀和體征, 需依賴實驗室檢查明確診斷［6-8］。目前, 對HCV復制活躍的患者, 早期開始抗丙肝病毒治療可望中止或延緩病變發展, 從而改善患者預后［9］。因此, 對HCV感染的早期診斷十分必要和迫切。目前, 對于HCV感染的診斷, 臨床上仍以檢測抗-HCV為主。

本實驗的258例患者中, 92例標本雖然抗-HCV陽性,但HCV-RNA陰性, 表示丙型肝炎病毒在體內停止復制；其中17例HCV-RNA介于實驗的臨界值, 表示丙型肝炎病毒在體內可能存在復制趨勢；149例HCV-RNA陽性, 表示丙型肝炎病毒在體內高度復制, 為抗病毒治療指征。同時, 在急性丙型肝炎的恢復期, 丙型肝炎病毒復制停止致HCVRNA轉陰, 而抗-HCV仍可存在一段時間。對于慢性丙型肝炎, 抗-HCV高滴度表示丙型肝炎病毒復制且有傳染性。ELISA法檢測抗-HCV和HCV-RNA的聯合檢測有助于丙型肝炎確診病毒血癥以及監控HCV的感染, 并及時進行抗病毒治療, 預防疾病嚴重化。

［1］ 托馬斯.臨床實驗診斷學.呂元, 朱漢民, 沈霞, 等, 譯.上海:上海科學技術出版社, 2004: 1277-1281.

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Result analysis of serum anti-HCV positive combined with HCV-RNA quantitative detection of 258

cases

PANG Li-na, XUE Jin-fang.Department of Clinical Laboratory, Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen

University, Zhuhai 519000, China

Objective To investigate the clinical significance of hepatitis C virus antibody (anti-HCV) combined with hepatitis C virus ribonucleic acid (HCV-RNA) quantitative detection in the diagnosis of hepatitis C (HC).Methods A total of 258 cases of HC with anti-HCV positive were detected by ELISA method and PCR-fluorescence probe for the HCV-RNA content.Results Among the 258 cases with anti-HCV positive, there were 92 cases of HCV-RNA negative as 35.66%, 17 cases of HCV-RNA weakly positive as 6.59%, and 149 cases of HCV-RNA positive.Thus, there were 57.75% of the HC patients with viremia.Conclusion ELISA method in combined detection of anti-HCV and HCV-RNA helps to diagnose viremia of HC, monitor HCV infection and conduct timely antiviral treatment.

Antibody to hepatitis C virus; Hepatitis C virus ribonucleic acid; Hepatitis C; PCR-fluorescence probe

2014-07-23］

519000 中山大學附屬第五醫院檢驗科