膜條酶聯(lián)免疫法檢測特異性IgE抗體的比對分析

彭潔雅 孫寶清 鄭佩燕

膜條酶聯(lián)免疫法檢測特異性IgE抗體的比對分析

彭潔雅 孫寶清 鄭佩燕

目的 比較酶聯(lián)免疫快速膜條法與熒光酶聯(lián)免疫測定法(unicap法)對9種常見血清特異性IgE抗體檢測結(jié)果的吻合度, 以及該膜條法按照儀器操作和手工操作結(jié)果的一致性比較, 從而驗證膜條法作為半定量檢測sIgE抗體的有效性。方法 收集來自臨床科室標(biāo)本80份, 用儀器和手工方法同時對10種物質(zhì)進行sIgE檢測, 分析兩種不同操作方法所得結(jié)果；另外選取部分標(biāo)本同時用膜條法儀器測定和unicap法對9種常見血清特異性IgE抗體進行檢測分析。結(jié)果 兩種實驗方法定性結(jié)果符合率較理想, 對于大部分檢測項目, 兩種操作方法定性結(jié)果一致性高。結(jié)論 HOB膜條法操作簡捷, 檢測成本低, 是一種值得推廣的定性檢測血清變應(yīng)原特異性IgE抗體的方法。

過敏原；特異性IgE; HOB膜條

過敏性疾病是一種常見病, 通常認(rèn)為, IgE是導(dǎo)致I型過敏反應(yīng)的主要抗體, 通過檢測患者血清過敏原特異性IgE(sIgE),可明確患者的過敏原, 對于疾病的診斷﹑指導(dǎo)預(yù)防和治療均具重要意義［1］。CAP變應(yīng)原檢測系統(tǒng), 已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用,但其所需樣本量大, 檢測成本高, 局限了其作為初篩檢測常規(guī)方法的推廣［2］。本研究旨在探討HOB膜條試驗法與unicap法檢測結(jié)果的一致性, 分析膜條法臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1～5月就診于變態(tài)反應(yīng)科和兒科門診有過敏性反應(yīng)特征的患者80例, 臨床癥狀主要包括哮喘﹑過敏性鼻炎﹑蕁麻疹。其中男性38例, 女性42例, 年齡3～78歲, 平均23.0歲。

1.2 方法和原理 患者分別采集靜脈血5 ml, 全部血液分離血清后, 移至 EP 管, -20℃保存待測。sIgE測定采用兩種方法：一種是unicap熒光酶聯(lián)免疫法；另一種是HOB膜條法, HOB膜條法采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)快速試紙條技術(shù)檢測血清中的過敏原特異性IgE抗體。測試條的檢測區(qū)域由多個反應(yīng)區(qū)組成, 其中包括一個陰性對照區(qū)和一個陽性對照區(qū)。患者血液樣本先與包被有多種過敏原的測試條進行孵育, 使得樣本中的特異性IgE抗體與測試條上的相應(yīng)過敏原結(jié)合。隨后去除未結(jié)合的抗體, 加入酶標(biāo)抗體, 孵育。隨后的清洗步驟會去掉未結(jié)合的酶標(biāo)抗體, 加入酶底物液進行反應(yīng), 產(chǎn)生可以直接觀察的顏色變化, 得出定性結(jié)果。亦可以通過專用過敏原掃描分析軟件, 得到半定量結(jié)果。本次實驗用膜條自動操作儀及手工用試劑盒對同一樣本進行檢測10種過敏原,分別為屋塵螨(D1)﹑貓毛(E1)﹑狗皮(E5)﹑花生(F13)﹑大豆(F14)﹑雞蛋(F1)﹑牛奶(F2)﹑豚草(W1)﹑艾蒿(W6)和交鏈孢霉,分別記錄檢測結(jié)果。以上所有檢測實行全過程質(zhì)量控制

1.3 結(jié)果判定 根據(jù)sIgE濃度(IU/ml)將結(jié)果分為0～VI級,其中“0”級為陰性, I～VI級為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0軟件分析, HOB膜條儀器測定結(jié)果與CAP法測定結(jié)果按照吻合度作分析, HOB膜條法儀器與手工法對比數(shù)據(jù)分析采用Kappa檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法各項結(jié)果見表1。以unicap法作為參照,評價膜條法和unicap法測定結(jié)果的吻合度。兩種方法共檢測237項, 檢測結(jié)果完全一致的為 203項, 即符合率為 85.6%。檢測結(jié)果不一致的為 34 項, 比例為 14.4%。牛奶(F2)的吻合度不理想, 只有68.09%。

2.2 HOB膜條儀器測定和手工測定結(jié)果對比見表2, 儀器測定整個程序由儀器完成, 操作簡捷, 但由于儀器進樣口和出樣口都為單通道, 所以當(dāng)儀器進行多樣品檢測時耗時比較長。手工法測定分別經(jīng)歷加樣﹑孵育﹑加試劑﹑多次洗滌﹑顯色等過程才能完成, 顯得比較繁瑣, 但實驗耗時相對較短。結(jié)果顯示, 大多數(shù)sIgE, 儀器與手工測定定性結(jié)果具有較高的一致性(Kappa系數(shù)＞0.6), 陽性符合率﹑陰性符合率﹑總符合率均＞95%。

表1 unicap法與HOB膜條儀器測定結(jié)果對比

表2 HOB膜條儀器測定和手工測定結(jié)果對比(標(biāo)本數(shù)：80)

3 討論

變態(tài)反應(yīng)病的診斷流程主要有三個方面：詳盡的臨床資料﹑體內(nèi)試驗和體外檢測結(jié)果［3］。變應(yīng)原體內(nèi)檢測技術(shù)通過皮內(nèi)注射﹑針刺﹑劃痕等方法將多種變應(yīng)原注入體內(nèi), 誘發(fā)I型超敏反應(yīng), 從而判斷是否對某種變應(yīng)原致敏, 但對于過敏體質(zhì)患者可能會造成不同程度生理或病理反應(yīng), 為慎重起見,目前已少有。與此相比, 體外sIgE檢測, 能同時檢測多種過敏原, 不受臨床用藥情況影響, 安全等優(yōu)點, 得到臨床廣泛應(yīng)用。在眾多sIgE檢測系統(tǒng)中, 基于熒光酶聯(lián)免疫原理的CAP系統(tǒng)最有代表性, 是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的變應(yīng)原檢測系統(tǒng)［4］。該法對sIgE的檢測準(zhǔn)確可靠, 結(jié)果與臨床相關(guān)性好, 但存在著價格昂貴, 檢測通量小等缺點。隨著過敏性疾病日益增多以及人們對該病的認(rèn)識, 一種經(jīng)濟﹑高效﹑快速的初篩檢測方法更能滿足臨床需求［5］。HOB膜條采用了高效級聯(lián)抗體放大(high efficiency cascade of antibody amplification, HECA)技術(shù), 與傳統(tǒng)的ELISA法相比, HECA技術(shù)包被的高質(zhì)抗原,使抗原決定簇充分暴露, 充分與抗體結(jié)合, 提高檢測的靈敏度, 其高純度的封閉劑, 避免樣本中非特異性IgE的結(jié)合, 提高檢測的特異度, 結(jié)合液采用定制的單克隆二抗, 高效特異的結(jié)合抗原抗體復(fù)合物, 有效地放大了IgE信號, 提高檢測靈敏度, 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。將多種抗原包被在一張纖維膜條上,通過一次反應(yīng)即可檢測多種sIgE。反應(yīng)后的膜條具有良好穩(wěn)定性, 原始結(jié)果可以長期保存。本次實驗表明：與傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”CAP法相比較, 檢測結(jié)果具較好符合性, 一些本地區(qū)常見的過敏原屋塵螨﹑貓毛﹑狗皮結(jié)果吻合度都比較好, 但牛奶的結(jié)果吻合度只有68.09%, 原因可能是抗原表位及其來源區(qū)域不一致導(dǎo)致結(jié)果差異［6］, 故本研究認(rèn)為對F2(牛奶) sIgE檢測HOB膜條法檢測結(jié)果與CAP方法相比較, 結(jié)果吻合度不理想。從本次實驗結(jié)果來看, 吸入性過敏原的吻合度高于食物性過敏原的吻合度。作為一種半定量/定性的初篩產(chǎn)品, 其檢測結(jié)果還是比較令人滿意的。同時, 針對HOB膜條全自動操作儀的特點(該操作儀擁有高達48條/次高通量,但由于儀器進樣口和出樣口都為單通道, 所以當(dāng)儀器進行多樣品檢測時耗時比較長), 故本研究也對HOB膜條儀器測定和手工測定結(jié)果進行對比, 結(jié)果顯示, 除F13和F2外, 其他種類過敏原, 儀器與手工測定的定性結(jié)果一致性都比較理想(Kappa均＞0.6), 陽性符合率, 陰性符合率, 總符合率也比較理想。F13(花生)一致性差主要是由于其陽性符合率低所造成的, 原因可能由于陽性標(biāo)本過少所造成的。F2(牛奶)陽性符合率, 陰性符合率都低, 結(jié)合該法與CAP結(jié)果的吻合度分析, 考慮HOB膜條法對于F2(牛奶)過敏原檢測結(jié)果可靠性有待提高。綜上所述, 對于一些標(biāo)本量比較少或者希望能在較短時間內(nèi)得出檢驗結(jié)果的實驗機構(gòu)來說, HOB膜條法手工測定對于檢測吸入性過敏原是一種可信賴的定性檢測方法。

本組實驗表明, HOB膜條法具有陰陽定性符合率與“金標(biāo)準(zhǔn)”unicap法較好的相關(guān)性, 該膜條自動操作儀, 利用單片機控制電機及接合機械配件替代人手操作, 使用者可根據(jù)不同試劑反應(yīng)條的要求編排其操作流程, 整個程序由儀器完成,操作簡捷, 檢測成本低, 是一種值得推廣的定性檢測方法。

［1］ Fontaine C, Mayorga C, Bousquet PJ, et al.Relevance of the determination of serum -specific IgE antibodies in the diagnosis of immediate beta-lactam allergy.Allergy, 2007,62(1):47-52.

［2］ 宋志強, 郝飛.變應(yīng)原檢測的再認(rèn)識.臨床皮膚科雜志, 2006, 35(5):333.

［3］ 葉世泰.變態(tài)反應(yīng)學(xué).北京:科學(xué)出版社, 1998:118-127.

［4］ 張升, 朱威.常用過敏原檢測方法的探討.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2011,5(19):5753-5755.

［5］ 王瑞琦, 尹佳.ImmunoCAP250 TM檢測過敏原特異性IgE抗體的方法評價.中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志, 2007,1(1):67.

［6］ 王美玲, 馮珍加, 李志艷, 等.斑點免疫印跡法檢測特異性IgE抗體的比對分析.中國實驗診斷學(xué), 2011,15(3):430-432.

510220 廣州市紅十字會醫(yī)院(彭潔雅)；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(孫寶清 鄭佩燕)

孫寶清